硕士学位论文-从中药虎杖中提取白藜芦醇工艺的研究.pdf

从中药虎杖中提取白藜芦醇工艺的研究从中药虎杖中提取白藜芦醇工艺的研究 study of isolation and purification of resveratrol from giant knotweed 学科专业：物理化学 研 究 生：马向辉 指导教师：孙淑清 教授 天津大学理学院 二零零六年十二月 中文摘要 中文摘要 白藜芦醇是一种植物抗菌素。它主要存在于葡萄的果皮、花生、桑椹、松树 （例如苏格兰松树、东方白松等）、蓼科植物（giant knotweed，即中药中的虎 杖）12科、31个属的72种植物中。人们第一次提纯出白藜芦醇是在1974年，植物 源是一种生长于秘鲁的豆类植物。 白藜芦醇是生物为抵抗环境压力 （如气候恶劣、 微生物侵染等）而产生的化学物质。白藜芦醇具有显著的药理和生物学作用，如 抗癌、保护神经、抗衰老、抗炎症以及延长寿命等。“法国悖论”即法国人的饮 食中含有大量的饱和脂肪，而患冠心病的人的比例却很少。研究发现，这是因为 法国人的佐餐葡萄酒中含有白藜芦醇。 在本文的工作中，以虎杖为原料，比较了浸渍法、索氏提取法以及普通的回 流法，确定了粗提白藜芦醇的工艺条件：分别以 4 倍、3 倍、3 倍体积的 80乙 醇水溶液分三次煮沸虎杖粉末提取白藜芦醇，而后合并三次的提取液，浓缩成膏 状物。将膏状物用 200ml 水稀释后，加热到 60后，趁热过滤。滤液冷却后用 300ml 乙酸乙酯分四次萃取，合并乙酸乙酯相，浓缩至干。 通过应用大孔树脂硅胶联合层析方法，从虎杖提取物中纯化白藜芦醇。改 进了用大孔树脂、 硅胶或离子交换树脂单柱层析的方法从虎杖中提纯白藜芦醇的 传统工艺。在对白藜芦醇提取成本影响不大的情况下，大大提高提取纯度。大孔 树脂硅胶联合层析法纯化白藜芦醇在文献中未见报道。 文中使用成分不变的洗 脱液洗脱，克服了梯度洗脱中的结果不宜重复、洗脱条件复杂的缺陷。而后分析 研究了层析条件， 确定了先以大孔树脂层析， 洗脱剂为乙酸乙酯乙醇混合溶液， 体积比为 3：2，洗脱速度为 1ml/min；而后以硅胶层析，洗脱剂为乙醇乙酸乙 酯混合溶液，体积比为 4：1，洗脱速度为 1min/ml。 以 hplc 检测上述双柱分步层析后的白藜芦醇纯度，分析得白藜芦醇含量达 到 87左右。以质谱分析产物的成分及纯度，得到的结果与 hplc 分析结果较 好的吻合。 关键词： 关键词： 白藜芦醇 分离 提纯 检测 大孔树脂硅胶联合层析 abstract resveratrol is produced by plants as an antifungal chemical. it is found in widely varying amounts in the skin of grapes, in peanuts, berries of vaccinum species, including blueberries, bilberries, and cranberries, some pines, such as scots pine and eastern white pine, and the roots and stalks of giant knotweed and japanese knotweed, called hu zhang in china. resveratrol was first isolated from an extract of the peruvian legume in 1974. resveratrol is produced in plants during times of environmental stress such as adverse weather or ecological attack. a number of beneficial health effects, such as anti-cancer, antiviral, neuroprotective, anti-aging, anti-inflammatory and life-prolonging effects have been reported. resveratrol is found as a constituent of red wine may explain the “french paradox” that the incidence of coronary heart disease is relatively low in southern france despite high dietary intake of saturated fats. in this paper, resveratrol in polygonum cuspidatum was extracted with organic solvent. by compare three different extraction technology，it was found that a circumfluence extraction gave better result. with further design experiments, we found the optimal conditions. further purification of resveratrol was carried out using macroporous resin-silicon gel cochromatography. the influence of elution liquid，velocity of elution was studied. the concentration of resveratrol was detected by hplc and ms. the purity of the product was up to 87. this process of applying macroporous adsorption resin -silicon gel to adsorb and purify resveratrol in polygonum cuspidatum was feasible. key words：resveratrol, isolation, purification, test iv 第一章 前言 目 录 目 录 第一章 前言第一章 前言.1 1.1 中药现代化 中药现代化.1 1.1.1 中药现代化的概念目的与意义.1 1.1.2 中药现代化主要技术.2 1.2 白藜芦醇 白藜芦醇.2 1.2.1 虎杖.2 1.2.2 白藜芦醇简介.4 1.2.3 白藜芦醇的生物学功能.6 1.2.4 白藜芦醇的制备方法.10 1.3 白藜芦醇的分析方法.12 1.3.1 高效液相色谱（hplc）法.12 1.3.2 色谱联用技术.12 1.4 论文的目的和意义.12 第二章 白藜芦醇的粗提第二章 白藜芦醇的粗提14 2.1 实验部分.14 2.1.1 实验药品及仪器.14 2.1.2 实验方法.14 2.2 最佳提取条件的探讨.15 2.3 本章小结.21 第三章 白藜芦醇提取液的大孔树脂硅胶联合层析纯化第三章 白藜芦醇提取液的大孔树脂硅胶联合层析纯化 .22 3.13.1 大孔树脂层析纯化部分22 3.1.1 实验仪器及药品.22 3.1.2 白藜芦醇的大孔树脂层析.22 3.1.3 纯化条件探讨3.1.3 纯化条件探讨.25 3.1.4 白藜芦醇纯度的检测3.1.4 白藜芦醇纯度的检测.34 3.23.2 大孔树脂硅胶双柱联合层析35 3.2.1 实验仪器及药品.37 3.2.2 实验方法.37 3.2.3 硅胶层析法分析.39 第一章 前言 3.2.4 白藜芦醇纯度分析.41 3.33.3 白藜芦醇的精制43 3.43.4 本章小结44 第四章第四章 结论45 参考文献参考文献.46 发表论文和科研情况说明发表论文和科研情况说明.52 致 谢致 谢.53 第一章 前言 第一章 前言 第一章 前言 中药是中华民族伟大的文化瑰宝， 从中草药中提取的天然活性成份具有独特 功能和生物活性，其中的有效成分是疾病防治、强身健体的物质基础，是药物的 主要来源之一。 自20世纪80年代开始进行的全国中药资源调查表明， 我国现有的 中药资源种类己达12807种，其药用植物11146种，药用动物1581种，药用矿物80 种。仅对320种常用植物类药材的统计，总蕴藏量就达850万吨左右。全国药材种 植面积超过580万亩，药材生产基地六百多个，常年栽培的药材达二百余种。野 生变家种取得了积极成果， 许多已成为主流商品。 对珍稀濒危野生动植物品种开 展了人工种植、养殖和人工替代品研究，成功开发活麝取香、活熊取胆及人工麝 香、人工牛黄等项研究；对南药和进口药材的引种也取得了可喜的成绩，形成了 一定的生产能力，药材进口的数量和品种明显减少。 在数千年的实践中， 积累了丰富的中药临床应用经验， 中医药典籍卷轶浩瀚， 统计的秘方、验方达三十余万首，有记载的就有六万余首，被国际上称为人类药 理学的原始资料，一批中药文献数据库已经建成。 1.1 中药现代化中药现代化 1.1.1 中药现代化的概念目的与意义 中药现代化是指将传统中药的特色和优势与现代科学技术相结合， 按照国际 认可的标准规范如药品非临床安全性研究质量管理规范(glp)， 药品临床 质量管理规范(gcp)以及药品生产质量管理规范(gmp)等对中药进行研 究、开发、生产、管理，并适应当今社会发展需求的过程。 中药现代化是一个历史进程， 是一项极其艰巨而复杂的系统工程， 它包括中 药材生产规范、标准化，中成药生产工艺科学化，质量标准客观化，剂型剂量精 细化，物质组成必须化及临床治疗针对化。实现这一标准应包括如下研究内容： 中药的生产与炮制工艺研究，包括科学种植、适时采收、合理加工；中药化 学成分的研究， 包括复方及单味中药化学成分研究， 加工过程中成分变化规律研 1 第一章 前言 究；中药制剂工艺研究，包括传统工艺的更新与提高及新剂型的开发；质量 标准研究，包括原料药，中间体及制成品的客观质量标准；中药药理研究，包 括传统的药性理论及现代实验药理学；临床疗效的客观评价。 中药走向现代化是历史赋予我们的重托， 是我国现实国情的需要， 我们要有 历史的责任感和紧迫感， 为中药早日实现现代化而努力奋斗， 让中药以治疗药品 的形式堂堂正正地走向世界，为人类的健康事业做出我们应有的贡献。 1.1.2 中药现代化主要技术 我国中草药资源相当丰富，并有着在中医理论指导下的长期用药经验。但是 要实现中药现代化，还必须利用现代科学方法阐明中草药产生作用的物质基础， 从分子水平上解决中草药药效学的问题。 中草药的现代研究与开发首先遇到的问 题就是怎样从复杂的中草药中提取分离出有效成分， 也就是说提取分离是中药现 代化的起点和重要任务之一。 中药现代化的技术主要有：超临界萃取技术、膜分离技术、蒸馏技术、树脂 吸附分离技术、微波协助萃取技术、液固分离技术、制备色谱技术、中药产品的 干燥制粒技术、纳米制药技术、细胞级微粉碎及细胞级粉碎中药技术、植物细胞 大规模培养技术、中药指纹图谱技术、透皮吸收新制剂等。 1.2 白藜芦醇白藜芦醇 1.2.1 虎杖 虎杖 （polygonum cuspidatum sieb.et zucc.） 为蓼科植物的干燥根茎和根。 春、 秋二季采挖， 除去须根， 洗净， 趁鲜切段或厚片， 晒干。 虎杖始载于 名医别录 ， 列为上品。本草纲目释其名称曰:“杖言其茎，虎言其斑也。”根据上述本 草叙述，可以认为历代所用的虎杖均指本品。虎杖别名有:大虫杖(药性论)， 苦杖(本草拾遗)，酸杖、斑杖(日华子)，苦杖根、杜牛膝(本事方)， 斑庄根(滇南本草)，大活血、紫金龙(南京民间药草)，酸汤杆、黄地榆 贵州民间方药集)，活血龙(浙江民间草药)。韩保升曰:“所在有之，生 下湿地，作树高丈余，其茎赤黄，二月三月采根，日乾。” 弘景在描述其形态 时曰:“田野甚多，状如大马蓼，茎斑而叶圆。”苏颂描述更为精确:“三月生苗， 2 第一章 前言 茎如竹笋状，上有赤斑点，初生便分枝丫，叶如小杏叶，七月开花，九月结实。 南中出者，无花，根皮黑色，破开即黄。” 虎杖生于湿润深厚的土壤，常见于山坡山麓及溪谷两岸的灌从边、沟边草从 及田野路旁，常成片生长。我国河北、河南、山东、江苏、安徽、浙江、江西、 福建、台湾、湖北、湖南、广东、广西、四川、贵州、云南、西减等省区均有分 布。其中，主产于湖南、安徽、广西、四川、去南等省区，且大多为野生。国内 外学者对虎杖的化学成分做了许多研究，近年来，仍有不少对虎杖中化学成分的 研究报道。概括起来，虎杖中主要含有蒽酮类化合物、芪类化合物、水溶性多糖 和鞣质等成分。 图11 中药虎杖 中药虎杖为我国传统中药。味苦、涩、性寒，归肝、胆、大肠及肺经，中医 学认为虎杖具有祛风利湿、 散癖定痛、 止咳化痰的功效， 临床上多用于关节痹痛、 湿热黄疽、经闭、咳嗽痰多、水火烫伤、跌打损伤、筋骨疼痛、痈肿疮毒等证的 治疗，在民间还被用作抗乙型肝炎及止血，效果良好。近年来，对虎杖药效作用 研究的报道也不断增多，简要概括如下虎杖中主要含有大黄素等蒽醌类成分、白 藜芦醇以及鞣质等。蒽醌类成分大黄素具有抗菌、抗肿瘤、解痉、杀灭钩端螺旋 体的作用; 芪类成分为其调血脂有效成分，具有对心血管、微循环系统的影响， 并且对血小板聚集、呼吸系统有作用。深度开发丰富而廉价的虎杖资源，形成高 附加值的高科技产品， 满足国内外多样化需求， 广泛应用于天然药物、 保健食品、 功能饮料中，具有巨大的社会和经济效益。 虎杖的化学成分很复杂，主要包括一下几类： 蒽醌及蒽醌苷：大黄素(emodin)、 大黄素6-甲醚(phyacion)、大黄酚 3 第一章 前言 (chrysophanol)、 大黄酸(rhein)、 蒽苷a(anthraglycosidea即大黄素-6甲醚-8-o-d- 葡萄糖苷)，蒽苷b(anthraglycosideb即大黄素-8-o-d-葡萄糖m)。 芪类化合物：白藜芦醇(resveratrol)、 白藜芦醇苷(polydatin)。 酚性成分：迷人醇(pallacinol),6 羟基芦荟大黄素(citreorosein)、 大黄素-8- 单甲醚(questin),6羟基芦荟大黄素8单甲醚(questinol)、 原儿茶酸 (protocate-chuieacid)等。 黄酮类化合物：榭皮素(quercetin), 榭皮素3阿拉伯糖苷 (quercetin-3-arabinosede),榭皮素3鼠李糖苷(quercetin-3-rhamnosede), 榭皮 素一3-葡萄糖苷(quereetin-3-glucosede), 榭皮素一3一半乳糖苷 (quercedn-3-galactosede)等。 其它：虎杖中含有一种分子量约6000的多糖，其中含38个单糖，由d-葡萄糖、 d半乳糖、d甘露糖、l-鼠李糖、l-阿拉伯糖构成。一种萘醌，即2甲氧基 6乙酰基7甲基胡桃酮(2-ethoxy-5-acetyl-7-methyljuglone), 游离氨 基酸，cu, fe, mn, zn和k等微量元素，葡萄糖欧鼠李糖贰以及鞍质。 另外，在嫩茎中含有酒石酸、苹果酸、柠檬酸、维生素c、草酸和一种有促 性激素作用的物质。 1.2.2 白藜芦醇简介 白藜芦醇(resveratrol，res)属芪类化合物，化学名为3,4,5三羟基1,2 二苯乙烯(3,4,5trihydrolystilbene)，分子式为c14h12 o3，相对分子量为228.25， 熔点为256258，261升华。具有顺、反两种结构（图12），反式结构更 为稳定，也更为普遍，而且生物活性也比顺式异构体强。白藜芦醇为无色针状晶 体，难溶于水，易溶于丙酮、乙醇、甲醇等有机溶剂。白藜芦醇具有一些特征颜 色反应， 可以定性检测白藜芦醇。 将适量白黎芦醇的甲醇溶液加入到不同试剂或 者进行光照实验，其颜色反应如表1-1。 4 第一章 前言 表1-1 白藜芦醇的颜色反应 作 用 条 件 特 征 颜 色 可见光 紫外光 氨，可见光 氨，紫外光 fecl3 k3fe（cn）6 磷钼酸 对硝基苯胺重氮盐 淡黄色 紫色荧光 黄色 亮蓝色 暗绿色 血红色 深蓝色 棕黄色 白藜芦醇广泛存在于植物（如葡萄、虎杖、花生等）中的多酚类活性单体， 存在的方式有游离态和糖苷态两种。它是植物在恶劣环境下或遭到病原体侵害 时，自身分泌的一种抵御感染的抗菌素。白藜芦醇苷的含量一般高于其苷元白藜 芦醇的含量，在人体中白藜芦醇苷能很快被水解为苷元。因此，在人体内直接发 挥生理作用的是白藜芦醇。虎杖是截至目前发现的含白藜芦醇最丰富的植物。 ho oh oh ho hooh （a） （b） a.反式白藜芦醇 b.顺式白藜芦醇 图12 白藜芦醇的结构式 fig 1-2 structure of resveratrol 白藜芦醇在植物中的含量受许多因素的影响，如植物品种、生长季节、气候 环境以及植物的成熟度等等1,2,3。而且在植物的个个部分含量也不同，例如在花 生中，花生红衣以及花生壳中白藜芦醇的含量要远高于花生仁中的含量2,3；在 葡萄中，白藜芦醇主要存在于葡萄皮，而在葡萄的果肉中的含量很少4。植物的 加工方法或者中药炮制方法对植物产品或者中药的白藜芦醇含量都有影响。 5 第一章 前言 1.2.3 白藜芦醇的生物学功能 白藜芦醇的潜在的生物学功能主要依赖于人体的吸收、 生物利用率以及代谢 方式。一些体内和体外的实验已经对白藜芦醇的吸收和生物利用率进行了研究。 最近一些体内实验表明，口服白藜芦醇后，约70存在于肌体的各个组织5。白 藜芦醇的存在形式会影响到其吸收效率， 但食物的形态对此并无太大影响。 大量 口服白藜芦醇后，在血液和尿液中会发现大量的白藜芦醇葡萄糖苷类化合物。 白藜芦醇有多种药理活性， 1940年人们首次从毛叶藜芦的根部分离得到白藜 芦醇6。此后，1963年nonomura等从传统的中药材虎杖中分离得到白藜芦醇7。 白藜芦醇在发现之初一直被人们认为是一种普通的植物抗毒素， 因此并没有引起 人们太多的关注。白藜芦醇真正引起广泛关注还是源于who于1989年开展的一 项关于心血管疾病的流行病学调查， 该调查发现同样是高脂饮食的法国人死于心 脏病的危险性却低于其它欧洲国家，即所谓的“法国悖论”现象。后经研究发现造 成该现象的重要原因在于法国人饮用较多的红酒， 而红酒因制作过程中采用葡萄 带皮发酵工艺， 使果皮中相当数量的白藜芦醇能够保留在红酒中， 研究者们因而 推断白藜芦醇对心血管系统具有保健功效。 随后人们陆续开展了白藜芦醇药理活 性的探讨，发现除了对心血管具有保护功能以外8，白藜芦醇还具有一定其他方 面的治疗作用，如：抗癌作用、抗菌、预防心脏病、保护肝脏、雌激素作用、防 辐射、免疫调节等。 1.白藜芦醇与心血管疾病。1.白藜芦醇与心血管疾病。 白藜芦醇能够预防心血管疾病的机理主要在于它能够阻止血小板的聚集。 血 小板是有骨髓中的造血干细胞分化来的一种无核的细胞， 它通过在伤口处聚集而 防治过量出血。许多因素（例如腺苷二磷酸（adp）、胶原蛋白、以及凝血酶等） 可以激活血小板，使其改变形态而在损伤的血管处聚集9，阻止出血。血小板的 过量聚集会导致心血管的疾病。用白藜芦醇预处理过的血小板可以抑制脂多糖 （lps）以及lps凝血酶激活的血小板之间的连锁反应10。体内以及体外实 验证明，白藜芦醇可以阻止钙离子通道的活化，抑制细胞内钙离子的增加，进而 抑制adp、胶原蛋白以及凝血因子对血小板的激活作用11,12。也有动物实验证明， 白藜芦醇能够抑制因过量摄入胆固醇引起的副作用。实验证明，白藜芦醇可以促 进血管扩张13 。使用白藜芦醇喂养的大鼠可以抑制有肾上腺素类物质引起的血 管收缩作用。 白藜芦醇还可以抑制kcl和no引起的血管收缩作用。 白藜芦醇还可 以预防ldl的氧化，氧化的ldl能在动脉中形成脂肪的块，进而诱发心血管疾病 14,15。白藜芦醇还可以作用在动脉血管的细胞信号转导途径，调节基因表达。白 藜芦醇可显著降低血清胆固醇、甘油三酯的含量。具有降血脂作用。动物实验表 6 第一章 前言 明，白藜芦醇能减少大鼠肝中过氧化类脂化合物的堆积降低血清中天冬氨酸氨 基转移酶(ast)和谷丙转氨酶(alt)的水平，降低脂质过氧化物(lpo)和减少血 清游离脂肪酸(ffa)。阻止鼠肝内微粒体adp和nadph诱导过氧化物的生成， 抑制血清总甘油三酯(tg)和脂蛋白脂酶(lpl)的提高，还可减少鼠肝中14c软脂 酸脂肪生成。 2.白藜芦醇与肝脏保护。 2.白藜芦醇与肝脏保护。 白藜芦醇有保护肝脏，抑制类脂质过氧化物在肝脏堆积的作用。黄兆胜等用 白藜芦醇苷对损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用 发现它能有效地保护损伤的 肝细胞，在110 1104mmoll浓度范围内使细胞存活率显著提高， l10-5mmoll使肝细胞存活率达887，接近于正常培养肝细胞水平。白藜芦 醇苷能降低邻苯三酚引起的一氧化氮(no)和丙二醛(mda)升高，抑制一氧化氮 合成酶(nos)活性，升高超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽过氧化物酶 （gsppx）活性，减少还原性谷胱甘肽(gsh)的消耗，从而保护肝细胞。白藜 芦醇对自由基系统引发的脂质过氧化反应有很强的抑制作用， 能明显降低组织 中的丙二醛含量，提高sod，cat，gahpx活性，对脑缺血及组织损伤有保 护作用。 3.白藜芦醇与炎症。 3.白藜芦醇与炎症。 前列腺素（pg）类物质可以介导炎症的发生。白藜芦醇可以降低血液中白 细胞释放pge2的量16，也可以显著降低pgd2的水平17。白藜芦醇可以抑制环加 氧酶2（cox-2）的表达，这种酶是前列腺素合成途径中的关键酶之一16,17。 实验证明这种抑制作用是由于白藜芦醇是通过作用于细胞信号转导途径而产生 的。 4.白藜芦醇的植物激素活性。 4.白藜芦醇的植物激素活性。 植物雌性激素是一种非甾类激素，可以结合在雌激素受体上，进而活化雌激 素激活的基因。 白藜芦醇的这种类似雌激素的作用也可以用来预防心血管疾病以 及其他雌激素相关的肿瘤。在患高血压的大鼠的血管平滑肌细胞中，白藜芦醇可 以抑制一些诱导细胞事件发生的物质的作用18。 这些物质可以诱发许多血管并发 症。白藜芦醇还可以预防女性绝经后的骨质疏松症。白藜芦醇可以促进造骨细胞 mc3t3-e1细胞的增值，诱导碱性磷酸酶的表达，这种酶是一种催化骨骼钙化的 酶。他莫西芬（tamoxifen）一种雌激素的抑制剂，能够阻断白藜芦醇对骨骼 钙化的促进作用。 5.白藜芦醇具有抗癌的作用。 5.白藜芦醇具有抗癌的作用。 目前已有多项动物试验和体外试验结果表明，白藜芦醇对某些癌症，如结肠 癌、乳腺癌、肺癌等具有一定的抑制作用19 23，但其具体的抗癌机制较为复杂， 7 第一章 前言 其抗癌作用可能是几种不同机制共同作用的结果， 当然也可能还有其它途径参与 到白藜芦醇的抗癌作用中。白藜芦醇的抗癌作用具有肿瘤类型的选择性，这可以 认为不同类型的肿瘤细胞对白藜芦醇的敏感性不同， 其具体原因还有待于进一步 探讨。鉴于白藜芦醇的潜在抗癌活性，加之与人类饮食关系较为密切，白藜芦醇 已成为肿瘤防治研究中的热点。但学术界迄今未能就其抗癌的具体机制达成一 致，从现有的研究结果来看，白藜芦醇的抗癌机制应该是多途径的：白藜芦醇 能抑制细胞色素p45o酶。细胞色素p450 (cyp)与癌症的关系十分密切，这是因 为许多环境致癌物都是间接致癌物， 它们能够诱导机体cyp的表达并经cyp代谢 活化为终致癌物，发挥其致癌作用。现已有很多关于白藜芦醇能通过抑制细胞中 cyp的表达，继而抑制致癌物活化而发挥其抗癌功效的研究报道24 26。抑制环 氧酶-2 (cox2)。(cox一2)是机体于非生理情况下形成的一种诱导性酶，很 多癌组织中(如食管癌、 大肠癌等)均发现有cox。 因此目前认为cox-2水平异常 增高可能是癌变的重要机制之一。研究证实，cox2在癌变过程中如此重要主 要在于它是花生四烯酸代谢的关键酶，花生四烯酸在cox2的催化下最终可转 化为前列腺素e2、白三烯4等，这些产物的异常表达能够通过与细胞膜受体结合 而改变细胞的生物学行为诱发肿瘤。许多研究发现，白藜芦醇能够通过选择性抑 制cox2的作用而抑制癌细胞增殖27,28。干扰细胞周期。细胞周期是细胞生 命活动的基本过程，细胞经过一个周期后一分为二完成增殖过程。鉴于过度增殖 是肿瘤细胞的一大特性， 因而细胞周期与肿瘤的关系一直是生命科学研究中的热 门课题，并且把干扰肿瘤细胞周期当作一个重要的肿瘤防治策略来研究。细胞周 期的正常进行离不开细胞周期调节因子，包括细胞周期蛋白(如cyclina、b、c 等)和周期蛋白依赖性激酶(cdk)组成的复合物、增殖细胞核抗原(pcna)、p53 等的推动作用， 不同阶段的细胞周期的过渡(如g1s、 g2-m)是在不同的调节因 子推动下完成的。现已有很多体外试验发现，白藜芦醇能通过抑制细胞周期调节 因子的表达而阻滞癌细胞周期的进行，从而抑制癌细胞增殖 21,22,29,30。抗新生 血管生成。 实体瘤组织由肿瘤细胞和肿瘤间质构成， 后者主要包括血管、 淋巴管、 结缔组织等，其中的血管对肿瘤细胞起到营养转运的作用，因而几乎癌症发展的 各个阶段都离不开新生血管的生成。考虑到血管生成在肿瘤发展中的重要地位， 加之血管内皮细胞大多不具有转移性和耐药性， 因而目前已把抗肿瘤新生血管生 成看成是一项很有发展前景并已得到临床应用的肿瘤防治措施。 正常机体组织中 的血管生成是在血管合成促进因子和合成抑制因子的调节下处于动态平衡， 但该 平衡在机体处于如炎症、缺血性心脏病、癌症等病理情况下就会被破坏而导致血 管生成的异常升高。 目前研究较为肯定的血管生成促进因子主要有血管内皮生长 因子家族(vegf)、成纤维细胞生长因子家族(fgf)、表皮生长因子(egf)等， 8 第一章 前言 而血管生成抑制因子主要包括血管稳定索、内皮抑素等。人们发现一些天然的和 人工合成的物质也具有抗血管合成的功效，白藜芦醇就是其中的一种。在体外实 验中，白藜芦醇也能够通过抑制血管生长而抑制多种癌细胞的恶性生长31 33。 抗核转录因子nfrb。肿瘤细胞最明显的特征就是增殖失控，而在肿瘤细胞 内与生长分化有关的信号传导障碍则是增殖失控至关重要的因素， 因此肿瘤的发 生在一定程度上可认为是细胞内信号传导异常的结果。nfrb是细胞信号传导 通路中处于枢纽位置的一种核转录因子，它在多种生物学过程中，包括与癌变相 关的细胞增殖、凋亡等都起到关键作用，因而一直是肿瘤防治研究的重要靶点。 截至目前已有大量实验结果表明白藜芦醇具有抗nf-rb异常活化的功能34,35。 诱导细胞凋亡。肿瘤的发生、发展不仅是由于细胞过度增殖，还与细胞凋亡的速 度过慢有关，细胞凋亡对肿瘤的发生、发展起到负调控作用。目前已有大量的实 验，尤其是体外试验结果表明，白藜芦醇对多种肿瘤细胞具有凋亡诱导作用。 fas-fasl途径。自从clement等于1998年首次报道白藜芦醇能通过fasfasl途径 诱导早幼粒白血病细胞株hl60和人乳腺癌细胞株t47d凋亡之后，随后大量的 研究结果证实了这一观点。随着研究的不断深入，一些学者发现白藜芦醇能够诱 导fas抗性细胞的凋亡，并在一些试验中发现fas或fasl抑制物并不能抑制白藜芦 醇的凋亡诱导作用，提示白黎芦醇诱导的细胞凋亡并不完全是fasfasl依赖性 的36,37。 而delmas等38在研究白藜芦醇对结肠癌细胞作用的试验中却发现， 白藜 芦醇虽然不能影响癌细胞表面fas或fasl的表达，但却能够促进fas聚集，并使 fas、fadd(fas相关死亡功能域)、促级联蛋白-8分布在胆固醇和鞘脂丰富的部 位(该重新分布与凋亡诱导信号复合体disc的形成有关)，还发现disc抑制剂能 够抑制白藜芦醇对sw480的凋亡诱导作用， 这说明白藜芦醇诱发sw480细胞的凋 亡与其诱导fas在癌细胞表面的重新分布有关。目前就fasfasl途径在白藜芦醇 诱导细胞凋亡中的作用尚存有很大争议。 p53依赖性途径。 野生型p53蛋白在凋 亡诱导中发挥重要作用，很多试验结果表明，p53依赖性途径可能是白藜芦醇诱 导细胞凋亡的重要机制 23,39 42。 影响bcl2家族表达以及线粒体途径。 bcl2 家族是参与凋亡启动与调控的重要蛋白质，它包括促进凋亡的bax亚族和抑制凋 亡的bc12亚族。现已证实，bax表达的增加和(或)bcl-2表达的抑制均可导致线 粒体膜渗透性的改变甚至破裂，继而引起线粒体细胞色素c的释放，而细胞色素 c可以进一步诱发凋亡的发生。 白藜芦醇能够通过上调上述细胞中bax蛋白的表达 以及下调bc1x蛋白的表达，继而诱导这些癌细胞的凋亡43 46。 6.白藜芦醇的抗氧化作用 6.白藜芦醇的抗氧化作用 作为一种植物多酚类， 白藜芦醇含有两个苯环共轭的乙烯基团已被大量的研 究结果证实具有较强的抗氧化活性。 白藜芦醇的浓度与抗氧化性能之间的函数关 9 第一章 前言 系已经建立。cadenas等47发现，经灌胃给予的白藜芦醇可以抑制kbro3诱导的 大鼠肾细胞dna氧化，具体表现为肾细胞中8-羟基脱氧鸟嘌呤生成量减少。另 有研究表明，白藜芦醇可在无毒性剂量下通过提高淋巴细胞的抗氧化物酶(主要 是谷胱甘肽过氧化物酶、还原酶)活性以及谷胱甘肽的含量而提高淋巴细胞的抗 氧化能力。 视网膜色素上皮细胞(rpe)的氧化被认为是引起老年视力下降甚至失 明的一大病因，king等48发现白藜芦醇能明显抑制rpe的增殖，并发现高浓度的 rev能够有效保护rpe免受过氧化氢引起的氧化损伤。铂类化合物能有效杀伤肿 瘤细胞， 但其巨大的副作用却一直是医学界亟需解决的难题， 而导致过氧化则是 该类化合物致机体副作用的机制之一。 olas等49发现白藜芦醇能够降低顺铂化合 物所引起的人血小板、 淋巴细胞和血浆中氧化值的升高， 并能够抑制血小板经铂 化合物作用后引起的前列腺素f2的升高(前列腺素f2是脂质过氧化的生物学标 志物)，olas因此推断白藜芦醇能通过其抗氧化活性而减轻铂化合物所引起的细 胞脂质、蛋白质和dna的氧化损伤。由以上可见，白藜芦醇的强大抗氧化活性 使之不仅在抗癌研究中成为热点， 还在其它与过氧化密切相关的疾病防治研究中 都占有重要地位。 1.2.4 白藜芦醇的制备方法 白藜芦醇因为这些生理代谢涉及到与人体健康密切相关的许多生理疾病， 不 仅关系到人们的健康， 更关系到人们的生活质量。 随着对白藜芦醇研究的不断深 入， 人们逐渐认识到了它的药用价值。 目前， 以白藜芦醇为原料生产的各种药品、 保健品，在国际市场上十分走红，需要量很大。目前白藜芦醇的生产技术主要有 1.2.4.1 直接提取法 白藜芦醇是植物的次生代谢产物，作为抗毒素存在于葡萄、花生、虎杖、藜 芦、决明等植物中，其含量通常低于05。 目前主要以含量相对较高的葡萄皮或虎杖为原料， 采用有机溶剂提取后经大 孔吸附树脂、硅胶柱层析、高效液相色谱分离的方法制备白藜芦醇。采用快速逆 流色谱法分离纯化白藜芦醇，不仅可提高产品纯度，还可降低生产成本。 由于白藜芦醇属于中等极性化合物，常采用乙醇、甲醇、乙酸乙酯水溶液进 行提取。姚宝书52等以葡萄皮渣为原料，筛选出乙酸乙酯为提取剂，所得粗提取 液经硅胶柱富集纯化，得到白藜芦醇产品。张敏53等以虎杖为原料，乙醇水溶液 为提取剂，并以超声波振荡、微波处理等方法辅助提取，确定白藜芦醇提取最佳 条件。 timothy和sanders等用80 乙醇提取去皮花生中自藜芦醇， 并通过gc-ms 对提取物进行定性分析，应用hplc对不同花生品种中自藜芦醇含量进行定量分 10 第一章 前言 析。目前这种方法应用比较广泛。 由于白藜芦醇酚羟基较少， 在水中溶解度较小， 在一定条件下它可与某些无 机碱、碱性盐形成酚盐而增加其在体系中溶解度。通过调节体系ph值，白藜芦 醇将重新沉淀出来，故可通过碱溶酸沉方法富集提取白藜芦醇。苏文强54等采 用碱性水溶液提取、调节溶液ph沉降方法，从虎杖中提取白藜芦醇，并考察碱 的种类、用量及酸的种类、用量对提取效果影响，确立白藜芦醇碱溶酸沉最佳提 取条件。 白藜芦醇是多元酚类物质， 在碱性条件下很容易被氧化， 而且温度越高， 白藜芦醇越不稳定。因此这种方法缺陷是非常大的，没有实用的意义。 1.2.4.2 化学合成法 白藜芦醇化学合成十分困难，步骤复杂，且需要较高成本，得率也不高，目 前，国内对这一方法研究还较少。李晓光50等以3，5二甲氧基苯甲醛和对甲 氧基苄基溴为原料， 经witting反应、 顺反异构化和去保护基三步反应合成白藜芦 醇，具有反应条件温和，收率高等优点。 1.2.4.3 植物组织培养法 现代生物技术的快速发展， 为植物组织培养奠定了基础。 采用组织细胞培养 法生产植物活性物质不受季节的限制。 不破坏自然资源， 植物组织的生长周期可 人为控制。 据报道， 上海某生物公司利用植物细胞大规模培养技术将植物细胞在 生物反应器中进行培养来生产白藜芦醇。 植物组织细胞培养法生产白藜芦醇的产 量是直接提取法的近3倍。西北大学生命科学院论证植物组织培养生产白藜芦醇 方法在理论上可行性。 白藜芦醇生产将不受季节限制， 可人为影响或控制植物组 织生长周期。在此基础上，郭斌等51通过利用hene激光辐照用根癌农杆菌株 感染过葡萄皮脱皮化组织，进行诱变处理，进一步提高白藜芦醇产量。 这种方法由于使用真核细胞培养、 细胞诱变等技术， 因此需要比较苛刻的培 养条件，而且技术不成熟，因此还没有被广泛应用。 1.2.4.4 超临界萃取法 曹庸55等采用超临界co2流体技术对虎杖中白藜芦醇进行萃取， 获得初步萃 取条件：萃取釜压力25 mpa，温度50；解析釜压力5.7 mpa，温度46，用无 水乙醇及cy(自制)作为改性剂，同时用hplc对萃取物进行白藜芦醇含量测定。 11 第一章 前言 1.2.4.51.2.4.5 高效逆流色谱法 高速逆流色技术(high-speed countercurrent chromatographyhsccc)是 由ito.y.在液液分配色谱的基础上建立的一项分离技术。它依靠聚四氟乙烯 (ptfe)蛇形管的方向性及特定的高速行星式旋转产生的离心场作用，使无载体 支持的固定相稳定的保留在蛇形管中。并使流动相单向、低速通过固定相。在短 时间内实现样品在互不相溶的两相溶剂系统中高速分配， 继而达到连续逆流萃取 分离物质的目的。hsccc技术已被广泛的应用于中药学、药学、医学、生物工程 以及食品等领域的分离提纯。 1.3 白藜芦醇的分析方法 国外报道过许多关于白藜芦醇的检测的方法， 主要是集中在葡萄和葡萄酒中 白藜芦醇的测定，国内主要是一些中药的测定，如虎杖、丙肝宁颗粒等。 1.3.1 高效液相色谱（hplc）法 高效液相色谱法具有快速、高效、重现性好、结果可靠等特点，广泛应用于 天然植物纯度的检测。高效液相色谱法在白藜芦醇检测中的固定相主要为c18， 即十八烷基键合相硅胶，流动相主要以乙腈水体系为主，也有用到甲醇水体 系。比例变化较大，从23: 77-40: 60不等。样品处理方法主要采用加热回流、索 氏提取法，提取剂有甲醇以及不同浓度的乙醇等。 1.3.2 色谱联用技术 国外对葡萄酒中白藜芦醇的保健作用、测定方法的研究进行的较早。国内则 起步较晚目前用于分析检测白藜芦醇的方法主要有:正相高效液相色谱法、反相 高效液相色谱56,57,58、气相-质谱联用色谱59-62、二次微分简易示波伏安法63以 及hplc-ms法64等。 1.4 论文的目的和意义 综上所述， 白藜芦醇具有确切的保健作用和重要的生理活性， 因此使其具有 广阔的市场空间和应用前景， 注重白藜芦醇及相关产品的研制与开发具有重要意 12 第一章 前言 义。 我国传统中药虎杖含有丰富的白藜芦醇， 湖南湘西地区拥有丰富的虎杖资源， 这为我国的白黎芦醇保健品的发展和进军国际保健品、 药品市场提供了坚实的资 源保证， 集中力量研究虎杖中白藜芦醇提取分离纯化技术具有显著的经济效益和 社会效益。因此对虎杖中白藜芦醇的提取及纯化进行系统深入的研究，不断深化 对获得高含量白藜芦醇的不同工艺方法的探讨，提高原料利用率，增加产品附加 值，开发一条高科技含量、流程短、成本低、对环境友好的工艺路线，以满足其 国内外市场的多样化需求势在必行。 本论文针对虎杖的开发利用现状，以价廉易得的虎杖资源为原料，以简化工 艺、提高纯度为指导原则，紧密围绕提高原料利用率，降低产品生产成本，比较 了几种由对虎杖中提取白藜芦醇的方法（包括浸提法、回流法、索氏提取法）， 确定了最优化的提取方法和工艺，改善了传统的常规溶剂提取法，克服文献报道 方法的不足。 另外，本文应用大孔树脂硅胶串联层析纯化方法，代替传统溶剂萃取、硅 胶柱层析法以及大孔树脂层析法对白藜芦醇进行富集纯化， 建立虎杖中白藜芦醇 的大孔树脂硅胶联合纯化工艺，确定最佳工艺参数。大孔树脂硅胶联合层析 纯化白藜芦醇法尚未见文献报道。相对于传统硅胶或大孔树脂单柱层析，大孔树 脂硅胶联合层析提纯法，能够大大提高白藜芦醇产品的纯度。相对于超临界萃 取法以及告诉逆流色谱提取法，大孔树脂硅胶联合提纯法具有工艺简单，操作 容易，对设备要求低等优点。 13 第二章 白藜芦醇的粗提 第二章 白藜芦醇的粗提 第二章 白藜芦醇的粗提 中药的有效成分的提取可针对新鲜样品， 但更多的是使用经晾干或低温烘烤 干燥后的样品。中草药成分相当复杂，其中主要有生物碱、萜类、糖苷、黄酮、 香豆素、糖、鞣质、氨基酸、蛋白质等等。在实验中，使用干燥后的虎杖粉末作 为白藜芦醇提取源材料。 2.1 实验部分 2.1.1 实验药品及仪器 乙醇 （分析纯） ， 天津大学科威公司 乙醇 （色谱纯） ， 天津大学科威公司 nacl （分析纯） 天津大学科威公司 乙酸乙酯 （色谱纯） ， 天津大学科威公司 滤纸 旋转蒸发仪 上海沪西分析仪器厂 2.1.2 实验方法 先将原料经粉碎处理， 采用有机溶剂(如甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯等)进行提取， 经过滤后将滤液浓缩，即得白藜芦醇粗品，再经过层析分离、提纯得到纯度较高 的白藜芦醇。目前，中药有效成分的提取方法较多。实验中综合比较了浸渍法、 回流法、索氏法。 2.1.2.1 浸渍法 将虎杖中药饮片粉碎后过60目筛。 取300g虎杖粉末， 加入一定量乙醇水溶液， 分别浸渍2，4，6，8，12，24小时，而后过滤，滤液于4保存。滤渣再用相同 体积相同浓度的乙醇水溶液浸泡数小时，重复两次。 2.1.2.2 普通回流法 取300g粉碎的虎杖粉末加入一定量乙醇的水溶液，浸泡一段时间后，加热到 乙醇微沸，回流提取30分钟。将提取液冷却后过滤。余渣再加入相同浓度的乙醇 14 第二章 白藜芦醇的粗提 水溶液提取，以同样的方法提取两次。将三次提取的滤液合并。 2.1.2.3 索氏提取法 将300g过60目筛的虎杖粉末用普通滤纸包好，放入索氏提取器中，索氏提取 器下部的烧瓶中加入250ml一定浓度的乙醇水溶液，放入几颗沸石，将索氏提取 器组装完毕后后开始加热回流，待回流液几乎无色后，停止加热。中药渣弃去， 乙醇溶液放冰箱中保存。重复上述提取步骤十次后，合并提取液。 2.1.2.4 除杂 白藜芦醇是一种多酚类化合物，多酚类化合物的极性强，它易溶于极性强的 溶剂；由于提取液所含组份比较多，应根据各组分的极性不同，选择不同极性的 溶剂进行萃取，萃取剂的选择是否合适，是决定能否有效萃取出的关键，因此宜 于采用极性由小到大的萃取剂进行多次萃取来分离。 用旋转蒸发仪将上述的乙醇溶液浓缩至膏状。将膏体中加入 200 毫升水，加 热到 70， 趁热过滤， 弃去滤渣。 用 0.01mol/l 的盐酸溶液将滤液的 ph 调到 4.0， 然后再升温到 60，保温 4 小时，以水解白藜芦醇苷。 水解后的溶液冷却后，用一定量乙酸乙酯萃取若干次，合并乙酸乙酯溶液。 将乙酸乙酯溶液减压蒸馏至膏状。将膏状物在真空干燥箱中挥发溶剂真空干燥， 得到褐色白藜芦醇粗提物粉末。 2.2 最佳提取条件的探讨 中药有效成分的提取法主要有以下几种：溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、分馏 法、沉淀及盐析法等。白藜芦醇极性较强，沸点较高，因而采用溶剂提取法比较 适宜。 在溶剂提取法中对溶剂的要求是： （1）溶解性能好，即溶剂对所需成分的溶 解性要大，对杂质的溶解性要小，或反之； （2）惰性，即溶剂不能与中草药的有 效成分发生反应，或即使反应也属可逆反应； （3）经济安全，即在选择溶剂时要 考虑经济易得、毒性小，便于回收和反复使用，并具有一定安全性，对环境污染 小。提取白藜芦醇原料主要为虎杖、葡萄皮渣、葡萄籽、花生红衣等，其中，虎 杖中白藜芦醇含量要高于其它植物。由于所用植物原料不同，提取物的组份也有 所不同，除含白藜芦醇外，大多还含有白藜芦醇苷、亚油酸、黄酮类、萜类、酚 酸类、酒石酸、单宁等多种组份，因此，为了提高白藜芦醇的纯度和收率，溶剂 的选择是否合适，是决定能否提出的关键，并且还要对提取物进行一系列的萃取 15 第二章 白藜芦醇的粗提 分离。几种通常使用的溶剂提取法如下： 水加热提取法。这是大多数中草药的传统提取方法。水对中药植物细胞的 穿透力极强，故提取率较高，适用于提取生物碱盐、有机酸盐、皂苷、黄酮、单 宁、蛋白质、多糖、无机盐等。但各种化学成分之间具有相互促溶的作用，一些 溶解度不好的物质也能随其他成分一起被溶解出来，而且水提取物易发霉变质， 不易保存，蒸发浓缩时比其他溶剂耗时耗能。一些多糖成分（如淀粉、果胶、粘 液质等）会使水溶液过滤困难。医药工业中常采用酸性或碱性水溶液作为提取溶 剂。 醇提。乙醇也常用与中药有效成分的提取，它是生物碱（游离态或与其他 酸类物质生成盐） 、皂苷、黄酮、内脂、挥发油、有机酸、单宁和叶绿素等成分 的良好溶剂。不同浓度的乙醇对提出成分的影响很大。例如 95的乙醇溶液时 生物碱、挥发油、树脂和叶绿素的适宜溶剂；6070的乙醇溶液适合于皂苷的 提取；4050的乙醇溶液用于强心苷及单宁的提取；2030的乙醇溶液则可 用来提取蒽鲲及其苷。甲醇也是溶解性较好的溶剂，但