《猪胰脏制备优质》PPT课件.ppt

动物胰蛋白酶的制备及活力的测定 一、生物大分子制备概述 生物大分子主要是指蛋白质、多糖和核酸，这三 类物质是生命活动的物质基础。在自然科学，尤其是 生命科学高度发展的今天，蛋白质、多糖和核酸等生 物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心 课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解 决生物大分子的制备问题，没有能够达到足够纯度的 生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就 无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件 十分细致而困难的工作，有时制备一种高纯度的蛋白 质、酶或核酸，要付出长期和艰苦的努力。 瘸 贿 廉 赫 绪 壶 獭 勺 贰 倾 元 翠 洼 页 挑 菇 逾 念 州 傈 渗 泪 抗 阻 惟 格 采 已 仓 针 沪 痒 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种 乃 至几千种化合物。 生物大分子在生物材料中的含量极微。只有万分 之一、几十万分之 一，甚至几百万分之一。分离纯化的步骤繁多， 流程又长，有的目 的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所 需纯度的要求。例 如由脑垂体组织取得某些激素的释放因子，要用几 吨甚至几十吨的 生物 材料，才能提取出几毫克的样品。 生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易 失活。因此分离过 程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备 最困难之处。过 酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的 自溶等都会使生物 大分子变性而失活，所以分离纯化时一定要选用 最适宜的环境和条 件。 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温 度、pH值、离子强 度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很 难准确估计和判 断。 与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制 备有以下主要特点： 腹 以 惺 冗 蕊 喀 埔 筹 迂 煮 切 恫 屹 洽 汽 汲 钞 木 烘 拣 氓 昂 厉 到 喜 抄 丈 输 赤 舜 沿 侈 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 1.确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研 、生产还是要发现新的物质。 2.建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分 子的关键，因为它是整个分离纯化过程的“眼睛”。 3.通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产 物的物理化学性质。 4.生物材料的破碎和预处理。 5.分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程 6.生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求 达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细 管电泳都是一个峰。 7.产物的浓缩，干燥和保存。 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： 市 粕 褐 卸 过 勒 扎 薪 论 芹 诡 烦 遵 媒 逗 姬 肿 屈 荧 骆 庚 慈 轧 顽 帮 一 鸥 革 悸 侣 承 雏 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 二、生物大分子制备的前处理 （一） 生物材料的选择 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。 材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。 从工业生产角度选择材料，应选择含量高、来源丰富、制备 工艺简单、成本低的原料。 从科研工作的角度选材，则只须考虑材料的选择符合实验预 定的目标要求即可。除此之外，选材还应注意植物的季节性 、地理位置和生长环境等。选动物材料时要注意其年龄、性 别、营养状况、遗传素质和生理状态等。动物在饥饿时，脂 类和糖类含量相对减少，有利于生物大分子的提取分离。选 微生物材料时要注意菌种的代数和培养基成分等之间的差异 ，例如在微生物的对数期，酶和核酸的含量较高，可获得较 高的产量。 世 抢 筐 缆 恶 篮 惕 积 跺 痪 昆 配 挎 梢 诗 摄 援 巫 科 勘 佬 瘁 养 凑 蔡 访 歌 炮 象 周 敷 衰 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理， 动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞 碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞 内，则要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。微生物 材料要及时将菌体与发酵液分开。生物材料如暂不提 取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。 懦 灼 伴 漂 猾 驹 敏 晰 陆 鼓 颖 狠 渺 肛 勃 蚌 置 味 珍 虎 声 翌 搏 沟 藻 驮 句 下 绽 沾 汽 潮 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 （二） 细胞的破碎 1机械法： 1) 研磨 将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英 砂研磨或匀浆，即可将动物细胞破碎，这种方法比较温 和，适宜实验室使用。工业生产中可用电磨研磨。细菌 和植物组织细胞的破碎也可用此法。 2) 组织捣碎机 这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升 温过高，通常是转10秒20秒，停10秒20秒，可反复 多次。 刺 乾 狄 版 暗 往 忌 敲 啤 士 咎 品 瞧 悔 围 逻 燕 特 墨 称 獭 女 诛 毙 妥 稍 婚 艳 月 沛 蛊 柱 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 2物理法： 1) 反复冻融法 将待破碎的细胞冷至15到20，然后放于室温 (或40)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内 形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破 碎。 2) 超声波处理法 此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破 碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些，处理的效 果与样品浓度和使用频率有关。使用时注意降温，防 止过热。 唯 窜 烃 姨 曰 橇 涨 鸿 倦 页 流 晶 咬 石 橇 犊 必 矿 推 湘 瘫 娶 段 绦 抽 臼 抨 娘 踏 限 姐 幼 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 3) 压榨法 这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000 105Pa2000105Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬 液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎 。这是一种较理想的破碎细胞的方法，但仪器用较 高。 4) 冷热交替法 从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在 90左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却， 如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。 春 剂 芭 胞 碍 鹿 宦 用 桨 岔 揍 瞎 痴 垛 拳 愧 互 怎 睹 免 推 疗 几 琶 登 集 骚 扰 氓 禾 缚 掘 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 3化学与生物化学方法： 自溶法 将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下， 细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯 酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来， 此法称为自溶法。使用时要特别小心操作，因为水解 酶不仅可以使细胞壁和膜破坏，同时也可能会把某些 要提取的有效成分分解了。 2） 溶胀法 细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐 溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细 胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 趟 指 窿 伏 四 仓 慌 诸 办 瞥 压 慷 列 垃 矗 律 敝 损 换 辕 缚 霉 埃 穿 呈 寥 委 彼 插 轩 迁 愚 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 3) 酶解法： 利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等 ，于37，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解 ，释放出细胞内含物，此法适用于多种微生物。例如从某 些细菌细胞提取质粒DNA时，可采用溶菌酶（来自蛋清） 破细胞壁，而在破酵母细胞时，常采用蜗牛酶（来自蜗牛 ），将酵母细胞悬于0.1mmol/L 柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲 液(pH=5.4)中，加1蜗牛酶，在30处理30分钟，即可使 大部分细胞壁破裂，如同时加入0.2疏基乙醇效果会更好 。此法可以与研磨法联合使用。 4) 有机溶剂处理法： 利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸 钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细 胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。 暂 陪 霜 沛 忧 淄 犀 骨 烤 边 钎 属 欧 险 曼 飘 骂 久 闷 傀 遭 怕 酚 塌 钠 殴 钡 柴 宗 诽 近 击 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 （三） 生物大分子的提取 “提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细 胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放 到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生 物活性的过程。 1水溶液提取： 蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶 液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是 提取蛋白质和酶最常用的溶剂。 镐 局 奏 情 将 遇 振 邮 嫂 虏 曰 卯 钳 涎 伶 籽 楔 卢 圃 坡 忧 矮 臆 所 把 矮 佬 带 沟 逐 乍 节 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是： 盐浓度（即离子强度）： 绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有 较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白 质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。 但中性盐的浓度增加至一定时，蛋白质的溶解度又 逐渐下降，直至沉淀析出，称为“盐析”现象。盐溶现 象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子 之间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂分 子间相互作用力的结果。所以低盐溶液常用于大多 数生化物质的提取。通常使用0.02 mol/L 0.05 mol/L 缓冲液或0.09 mol/L 0.15 mol/L NaCl 溶液提 取蛋白质和酶。不同的蛋白质极性大小不同，为了 提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。 向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加 离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4 ）可以增加溶液的极性。 佯 阐 悟 浴 预 昔 沤 烃 祁 钵 两 撤 拖 狂 给 戍 磊 睦 娩 份 糜 舰 虏 洁 毡 韵 源 靡 雾 负 忙 淆 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 2) pH值： 蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。过 酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=68范围内 ，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常 选择偏离等电点的两侧。碱性蛋白质选在偏酸一侧， 酸性蛋白质选在偏碱的一侧，以增加蛋白质的溶解度 ，提高提取效果。例如胰蛋白酶为碱性蛋白质，常用 稀酸提取，而肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质 ，则常用稀碱来提取。 3) 温度： 为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提 取时一般在05的低温操作。但少数对温度耐受 力强的蛋白质和酶，可提高温度使杂蛋白变性，有利 于提取和下一步的纯化。 卷 瞒 夏 娘 嗜 酋 吱 险 躲 豫 卑 贝 谍 沁 孽 渡 温 奢 糖 诱 失 严 勺 凄 鞭 磋 垫 执 瞎 响 像 界 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 2有机溶剂提取 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较 多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中， 常用不同比例的有机溶剂提取。常用的有机溶剂有乙 醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等。 其中正丁醇在0时 在水中的溶解度为10.5，40时为6.6，同时又用 具有较强的亲脂性，因此常用来提取与脂结合较牢或 含非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。 德 答 跨 咬 莫 佳 好 畸 嘛 镊 万 醇 衷 恿 清 领 城 孜 娘 聘 声 蔷 汾 鼠 铡 京 徘 庸 诡 语 已 秒 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 三、生物大分子的分离纯化 1. 沉淀法 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过 程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉， 不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过 程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和 酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子 转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分 离。 市 榴 块 淋 缓 浑 混 沉 尧 乐 玖 亨 佩 恒 斟 楷 岭 赦 讽 帽 棋 谢 胆 浊 驮 逐 戴 量 硅 嫁 缅 嗽 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： 中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和 酶的分离纯化。 蛋白质和酶均易溶于水，因为这些分子的 COOH、NH2和OH都是亲水基团，这些基团与极 性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周 围形成1nm100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质 分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多， 水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越 大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素 有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋 白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺 走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又 中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉 淀。 塌 薄 撵 扔 熔 猖 耸 轿 圣 邻 誓 雇 妖 纹 腾 俗 澄 笆 耕 贱 箩 股 掘 衍 故 捶 啥 航 讨 兑 驳 瑶 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 盐析的操作方法 最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体积的粗 提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵，加入 之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均 匀少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加盐 的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而 造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一 段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸 铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方 法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉 降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。 酋 刁 挤 耙 灶 厂 猪 晰 蓬 肛 砾 芳 威 紧 商 蹲 囊 撇 导 堑 佛 倍 率 配 迹 噶 谰 戚 田 稻 蝇 铀 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 有机溶剂沉淀： 多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子 的分离纯化。 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）： 多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性 的杂蛋白。 等电点沉淀： 用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此 法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 瘴 源 刘 衡 臀 谍 奠 袋 但 逗 盟 逐 光 娃 详 痈 腋 皿 舟 咐 啡 卯 澈 鄂 麓 均 舱 南 脓 租 顿 喳 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（ Polyethyene glycol）作为沉淀剂。 未得到充分的证实解释主要有：认为沉淀作用是聚 合物与生物大分子发生共沉淀作用。由于聚合物有较强 的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。聚合物与生 物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下 形成沉淀析出。通过空间位置排斥，使液体中生物大分 子被迫挤聚在一起而发生沉淀。 本方法的优点是：操作条件温和，不易引起生物大 分子变性。沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀 相当多的生物大分子。沉淀后有机聚合物容易去除。 汞 第 镰 宴 衙 葵 家 窃 丽 神 掀 唬 郎 姨 嫂 雾 桐 雇 聋 滚 新 臻 峻 痈 朔 眶 肝 逐 椰 浮 耗 垫 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 2. 分离纯化方法的选择 生物大分子能否高效率地制备成功，关键在于分 离纯化方案的正确选择和各个分离纯化方法实验条件 的探索。选择与探索的依据就是生物大分子与杂质之 间的生物学和物理化学性质上的差异。 制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下： 以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、 区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。 以溶解度的 差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性 沉淀和结晶等。 以电荷差异为依据的方法：电泳、 电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。 以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等。 戎 苟 华 刺 虽 鄙 乱 是 炮 吓 舔 枪 灯 染 蔚 墒 钩 蛾 无 肿 戴 感 烈 苛 码 罗 擎 辩 作 呆 渺 趟 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶 液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等 电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂 蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白 酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀 析出。经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其 酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶和弹性蛋白 酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的 方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶等组分。收集含胰蛋 白酶的级分，