分子生物学研究进展

分子生物学研究进展 叶斯哈提【摘要】 植物组织培养中，花药培养已成为获得单倍体及纯合体的有效途径。花粉培养是在花药培养基的基础上发展起来的技术。植物花粉培养在单倍体育种上具有重要意义。植物器官脱落是自然界普遍的现象。器官脱落时离区细胞的细胞间质和细胞壁发生降解，导致远端器官离开母体，落粒性是作物栽培和育种中的重要农艺性状，但直到近年人们才对禾本科植物落粒的分子机制有了新的认识。增殖性细胞抗原是DNA 复制的关键成分之一,他与DNA 的损伤修复、细胞周期调控,染色体甲基化、染色体重塑等过程有密切关系,与不同的调控蛋白相结合,增殖性细胞抗原可发挥多种不同的作用。该文分别从植物花粉培养、植物器官脱落、增殖性细胞抗原三个方面简要综述了分子生物学的研究进展，和对该学科的展望 。 Research progress of molecular biology YE_sihati Plant tissue culture, anther culture has become an effective way to obtain haploid and pure fit. Anther culture is developed on the basis of anther culture techniques. Plant pollen culture is of great significance in haploid breeding. Plant organ prolapse is a common phenomenon nature. Organs when fall off from the cells of the stroma and degradation of cell wall, causing distal left mother organ, fall grain sex is an important agronomic traits in crop cultivation and breeding, but only in recent years, people of gramineous plants fall grain of a new understanding of the molecular mechanisms. Hyperplastic cell antigen is one of the key components of DNA replication, he and DNA damage repair, cell cycle regulation, chromosome methylation, there is a close relationship between chromosome remodeling process, combined with different regulatory proteins, hyperplastic cell antigen can play a number of different functions. This paper respectively from plant pollen culture, plant organ prolapse, hyperplastic cell antigen three aspects briefly summarizes the research progress of molecular biology, and the outlook of the discipline. 关键词:花粉培养；器官脱落；增殖性细胞抗原；研究进展 一 植物花粉培养1 植物花粉培养的研究目的和意义在植物组织培养中，花药培养已成为获得单倍体及纯合体的有效途径。花粉培养是在花药培养基的基础上发展起来的技术。它无论对遗传基础理论的研究， 还是对单细胞育种实践以及植物遗传工程，都有重要意义【1】。花粉培养区别于花药培养之处是：前者属于单细胞培养，而后者属于器官培养范畴。在游离花粉培养中，雄核发育是在脱离花药内环境的状况下独立进行的， 这是花粉培养不易成功的重要原因【2】。植物花粉培养的主要目的，一是获得纯系育种材料和进行单倍体育种，以利用杂种优势，缩短育种年限和提高育种效率。二是用所获得的纯合二倍体材料进行植物遗传变异规律研究， 使植物育种有坚实的遗传理论为依据，减少育种的盲目性。三是克服远缘杂种的不育性，获得具有双亲优良特性的可育远缘杂种。四是利用在远缘杂交F1 代的花药培养中出现的混倍体和丰富的染色体变异材料进行植物细胞遗传学等基础性研究。2 花粉培养的研究概况单倍体在育种上具有重要意义。植物自发出现单倍体的频率极低， 于是人们尝试用人工方法获得单倍体。自从1964 年印度的Guha 和Maheshwari 首次成功地从茄科植物毛叶曼陀罗获得单倍体花粉植株，20 世纪60 年代末到80 年代初许多国家的花药培养研究工作进入了一个迅速发展的时期。到1983 年，有247 种植物获得花粉植株，其中包括杏、桃、扁桃、樱桃、咖啡、柠檬、枸橼、柑桔、苹果、楸子、葡萄、荔枝、茶树、番木瓜、橡胶树、枸杞、香蕉、草莓等果树和经济林树种。木本植物花粉植株最早是波兰学者Zenkteler（ 1972） 在药用灌木植物滨藜叶枸杞中获得成功的。仅隔3 年，中国在黑杨（ Populus nigraL.） 上成功诱导出国内第一例木本花粉植株【3】。以后中国相继在橡胶树、柑桔、葡萄、苹果、荔枝、龙眼、中宁枸杞、茶树、金花茶、枳壳、锦丰梨、猕猴桃、枣【4】等近30个树种上首先获得花粉植株。其中杨树、橡胶树和苹果等花粉植株已经在生产上利用。花粉培养比普通的茎段、茎尖等的组织培养要复杂得多。国内外对如何有效刺激雄核发育，以提高花粉植株的诱导频率方面研究得比较多。现在已基本弄清离体条件下雄核发育的途径及影响雄核发育的主要因子。一般认为花粉发育时期、预处理（ 低温、高温、离心等） 、营养和调节因子、供体植株基因型和生理型等对雄核发育有明显影响。研究中还发现“ 药壁因子”在花粉雄核发育中起重要作用，但目前“ 药壁因子”的作用成分还不清楚，只发现谷氨酰胺等能部分取代“ 药壁因子”的作用【5】。对雄核发育的生化及分子机理目前了解得还很少。对花粉植株的倍数性研究得也较多。多数植物花药培养中再生的植株中常常出现混倍现象，有单倍体，二倍体，还有多倍体及非整倍体。单倍体组织在培养中很容易发生多倍化。人工加倍（ 秋水仙素等处理） 可加速二倍化进程。纯合二倍体与染色体变异体对树种改良均具有重要价值， 但出现较高的倍数性或非整倍体则是一个严重的问题（ 对生产单倍体而言） 。目前还很难控制花粉植株染色体倍数。近年来， 研究的重点转向于雄核发育的生化机制及花粉植株或纯系的进一步利用， 尤其注重与诱变育种、染色体工程、基因工程、分子生物学等的结合。如:与染色体工程相结合， 中国科学院遗传所找到了一条快速有效创制附加系、代换系和易位系的新方法，已成功地培育出高抗的小麦/ 黑麦易位系。3 存在问题及展望植物花粉培养研究取得了很大进展， 但在理论和应用上仍存在许多问题，远远没有达到建立起完善、高效的花粉培养再生体系的程度。3.1 花粉培养中的诱导单倍体植株的发育调控及其分子机理研究不够小孢子的诱导机制、启动机理、发育途径及其与生理生化变化的关系等都尚不明确，有待进一步研究小孢子的发育调控机理，从而主动地进行调控，以定向增加突变，筛选目的性状，增强育种的可预见性，这将是花粉培养育种的发展方向。根据细胞全能性的原理， 理论上每一个花粉粒都可以发育成一个完整植株。但事实上有的基因型尚得不到单倍体，有的胚发生率太低，没有应用价值。可见，花粉成胚与否受遗传基因控制。应加强基础理论研究，从根本上解决花培效率低的问题。3.2 培养方法没有达到普遍的最优化培养基成分及培养条件间相互作用关系还不清楚，胚状体或愈伤组织的诱导率和分化率较低，不定芽生长能力差，结果造成成苗率低，植物再生周期长，白化苗增多等，这些尚有待进一步深入研究，以建立植物花粉培养的最适体系。3.3 花粉培养易受到体细胞的干扰在花粉培养的培养过程中，花药壁、绒毡层组织会不可避免地通过愈伤组织阶段形成胚状体。目前主要通过提高蔗糖浓度， 减少或不用2,4-D 来诱导花粉愈伤组织，而采用NAA 和6-BA 配合使用来避免体细胞对花粉培养的干扰，但对一些植物种类效果不明显，没有从根本上解决问题， 这给染色体倍性鉴定带来了麻烦，所以如何有效的控制体细胞干扰，需要进一步的研究。总之， 花培养技术是迄今为止创造纯合基因型的最有效手段， 加强花粉培养体系中关键技术和遗传机理的研究，使花粉培养与基因工程相结合，解决花粉培养对基因的依赖性，提高花粉培养效率，将为花粉培养的应用开创一个新的局面。二 植物器官脱落植物器官脱落不仅对于物种的繁殖和传播有重要的生物学意义，而且对于农业生产具有重要的影响。在长期作物驯化实践中，人类不断地对作物器官脱落特性加以选择，成功地解决了禾本科植物落粒、断穗，棉花落铃，豆类作物提前开荚等问题，减少了产量损失。在番茄中，无离区品种的应用不仅可以提高机械收获和后续加工的效率，而且可以减少果柄对果实造成的机械损伤，提高果品质量。对于植物器官脱落的研究，早期主要侧重于生理生化方面。近年来随着分子遗传学和细胞生物学的发展，解析离区发育和器官脱落的分子机制成为分子生物学研究的热点之一。1 器官脱落及其原因器官脱落是指植物组织或器官脱离母体的生理过程。它是植物应对外界环境(如病原物侵染)或放弃那些不再发挥作用的器官的有效机制。器官脱落的组织区域及邻近的数层细胞被称为离区【6】。器官脱落可以是衰老或成熟引起的，比如果实、种子的脱落；也可以是自身生理过程引起的，例如营养生长和生殖生长的竞争引起的落花等；逆境条件如干旱、高温、病虫害等是其另一主要原因。激素，尤其是乙烯在植物器官脱落过程中起着重要的作用。但一些植物(如柑橘)的果柄并不受乙烯诱导而脱落。生长素在器官脱落中与乙烯的作用相拮抗，它控制离区细胞在适当的时间对乙烯产生应答。ABA (abscisic acid)，即脱落酸，对一些植物的叶片和花器官脱落具有诱导作用，但有实验表明其作用是通过乙烯间接实现的。植物器官的脱落是多种激素平衡和协同作用的结果。脱落过程往往伴随一系列基因表达的变化，特别是编码细胞壁降解酶基因如1,4-葡聚糖酶、多聚半乳糖醛酸酶等的上调表达。另外，扩展蛋白(expansin)、病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins)以及其他一些蛋白在器官脱落过程中也起着重要的作用。2 研究趋势和展望落粒性是作物栽培和育种中最重要的农艺性状之一。控制种子和果实的脱落程度是植物器官脱落分子生物学基础研究在农业实践中的应用。近年来关于离区发育过程中的信号转导途径和分子机制研究提出了许多有趣但目前无法解释的科学问题。如在拟南芥中，花器官脱落信号传递可能存在乙烯依赖和非依赖两条途径，但这两种途径相互交叉、部分重叠的细节并不清楚。同样，水稻谷粒和番茄果实离区发育的基因网络也有待进一步研究。此外，有关离区发育和器官脱落的研究也应当扩大到其他重要的粮食和经济作物中，如棉花的落铃和大豆的开荚等实际问题。在棉铃脱落方面，以前的研究主要集中在植物器官中的激素含量和棉铃脱落的关系以及脱落过程中发生的各种细胞壁降解酶的活性及作用，而在该领域的分子机制几乎为空白。随着中美两国科学家联合开展的“国际棉花基因组测序计划”的实施及完成，人类有望在不久的将来会对该领域的分子生物学研究有所突破【7】。大豆开荚的研究中也存在着类似的问题，分子机制方面的研究还没有突破。在小麦中，对人们早已观察到的西藏半野生小麦成熟期下穗轴脱落现象的研究，可以为改良现代小麦收获提供理想的品系。小麦由于存在基因组大、多倍性等阻碍基因克隆的问题，希望能随着小麦基因组测序的进行和完成得到缓解，从而加快落粒相关基因的克隆速度。春华秋实，植物器官脱落在自然界的普遍存在说明它是一个非常重要的生理过程。器官脱落几乎涉及植物生长发育的所有方面，从种子、果实、叶子脱落到果荚开裂等。所以，植物器官脱落的分子生物学研究一方面将深化人们对其本质的认识，另一方面将为其在农业生产上的应用做出重要的贡献三 增殖性细胞抗原增殖性细胞抗原(proliferating cell nuclear antigen , PC2NA) ,又称为周期素,是一种酸性、无组蛋白、结构保守的细胞核多肽,广泛存在于生物界,由Miyachi 等于1978 年在研究系统性红斑狼疮患者血清中的自身抗体(抗核抗体) 时发现,并证明其与细胞增殖状态密切相关。以后的研究证明,PCNA 不仅参于细胞增殖,还与DNA 的损伤修复【8】、染色体甲基化、染色体重塑有密切的关系,可以认为PCNA 是DNA 复制相关事件的分子开关。PCNA 有两种存在形式:一种是可溶性,存在于静止和增殖细胞中,与DNA 疏松结合或游离于核内,易被非离子型去污剂等清除,在经非离子型去污剂处理的组织细胞中消失;另一种为不溶性,主要存在于复制中的细胞,与DNA 紧密结合,与DNA 复制有关,不易被非离子型去污剂等清除,故而免疫组化反应检测到的为不溶性PCNA。紫外线照射静止期的细胞时,可溶性的PCNA 立即转化成不溶性的PCNA ,并结合DNA上,与S 期PCNA 的转化非常相似。在研究人皮肤干燥症时发现【9】,当PCN A 基因突变时,细胞的核苷酸切除修复功能明显减弱。PCNA 含有261 个氨基酸,其中酸性氨基酸多于碱性氨基酸,等电点约4. 84. 9 ,偏酸性,对胰蛋白酶敏感,加热至56 持续30 分钟即可使之失活。人PCNA 的基因位于20 号染色体上,可能与20p12 相近,其含有9461 个碱基对,可分为5个内含子和6 个外显子,长约710 KB ,内含子内部及其与外显子之间存住广泛的重复序列,在5端和3端存在广泛的侧翼序列,在其5端帽子结构上游45bp395bp 之间有一启动子活性区,它的mRNA 为113 KD ,人PCNA 启动子属于无TATAA盒、有GC 盒( GGCGGG 或CCGCCC) 类型的启动子。研究表明,PCNA 表达位于核内。在正常的细胞增殖周期中, G0 期含量很少, G1 晚期开始增加,S 期达到高峰, G2 、M 期明显下降,这与抑制细胞增殖的药物作用机制是一致的。PCNA 表达受多种因素的调节:生长因子、白细胞介素2 、ConA (刀豆蛋白A) 和抗原ppD (半型结核杆菌纯化蛋白衍生物) 能促进PCNA的增殖,而一些作用于G1 期的抑制细胞增殖的药如地塞米松、环抱素A 可以抑制PCNA 的表达,而作用于S 期、抑制DNA合成的药物,如阿糖胞苷、羟基脲并不能阻止PCNA 的表达。多种检测方法均可检测PCNA ,例如免疫组织化学染色、west2ern blot 法以及流式细胞仪定量检测法等。PCNA 的作用范围十分广泛,参与细胞增殖、DNA 损伤修复的各个过程,甚至在染色体转录过程也有重要作用,但是PCNA 的作用分子生物学机制、促进和抑制PCNA 合成的机制、PCNA 的修饰时间及机制等方面仍有众多的未知之谜,需要更深入的研究。【参考文献】1 中国科学院上海植物生理研究所细胞室编译. 植物组织和细胞培养M.上海:上海科学技术出版社,1987:23-27,232-267.2 胡含. 植物体细胞遗传与作物改良M. 北京: 北京大学出版社, 1986:1-12.3 王敬驹,朱至清,孙敬三.杨树花粉植株的诱导J.植物学报,1975,17(1):56-59.4 王震星.金丝小枣花药离体培养再生植株研究J.河北果树,1996,(3):9-10.5 Ochatt SJ, Zhang YX, Jain SM, In Vitro haploidization of fruit trees J. Current Plant Science and Biotechnology in Agriculture,1996, 25:193-21.6 Bleecker A B, Patterson S E. Last exit: Senescence，abscission, and meristem arrest in Arabidopsis. Plant Cell, 1997, 9: 116911797 Guinn G, Brummett D L. Changes in Abscisic Acid and Indoleacetic Acid before and after Anthesis Relative to Changes in Absc