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文档简介

聚合酶链链反应应（PCR） 聚合酶链（PCR）技术 PCR反应体系 PCR技术过程及原理 . 聚合酶链链反应应技术术 聚合酶链反应（PCR）技术是一个能在试管内模仿细胞内 核酸复制过程，也就是能在体外特异地扩增一段特定核酸 序列的技术 . PCR的反应体系 参与PCR反应的成分： 模板 引物 dNTP Taq DNA 聚合酶 Mg2+ 缓冲液 . 模板：即为要被复制的核酸片段 条件：需要较高的纯度 . 引物：化学合成的寡核苷酸 条件： 1.一般长度为20个核苷酸 2.两条引物的序列不能互补 3.两条引物之间的Tm值不能相差太多 . dNTP:4种核苷酸 条件：4种核苷酸的浓度需要一致，否则容易出现DNA聚合酶错 配的概率 . Taq DNA聚合酶：是从水栖嗜热菌中提取的一种酶，能催化DNA 合成。具有5端3端的外切酶活性。 . Mg2+：是Taq DNA聚合酶的辅助因子，可以稳定其活性 . 缓冲液：在扩增过程中使PH值维持在7.2左右，使DNA聚合酶 发挥最大的活性 . PCR技术术基本过过程 变性 退火 延伸 . 变变性 在熔点温度的条件下（94左右），使双链DNA结构的氢键断裂 ，形成两条单链分子作为扩增反应的模板，以便与引物结合。 94 DNA双链解开 . 退火 将反应体系温度将至熔点温度以下（4070），以便使 引物与模板DNA序列互补，形成杂交链。 4070 引物与DNA模板杂交 . 延伸 将反应体系的温度升至72，此时反应体系按照模板链的 序列以碱基互补配对的原则一次把dNTP加至引物的3端 ，在Taq DNA聚合酶的作用下，杂交链不断延伸，直至形 成新的DNA双链。新的DNA又可以作为下一个模板进行 扩增，如此反复循环，可以到达数十万倍到百万倍的扩增 数 72 4种dNTP在引物和DNA聚合酶的 的作用下延伸 . 定量PCR技术 指在PCR反应体系中加入了荧光基团，利用荧光信号累积实时 监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分 析的方法。 . Taqman荧光探针： 5端荧光基团 FAM 3端淬灭基团 . PCR扩增时，Taq酶的5- 3 外切酶活性将探针酶切降解，使 探针上的荧光基团和淬灭基团分 离，使荧光基团在激发光作用下 发出荧光； 每扩增一条DNA链就有一个荧 光分子形成，实现了荧光信号的 累积与PCR产物形成完全同步。 16. 荧光阈值 在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩 增产物量的标准)。 阈值线 实时定量PCR的两个重要概念 17. Ct值(cycle threshold)的概念 指PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号)到达阈值时所经过 的扩增循环次数。它与起始拷贝数的对数成线性关系（即与起 始拷贝数反比关系） C(t) 值 C(t) 值 18.12 +/0.04- 阈值线 18. 方法学评价：
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