【医学ppt课件】ifn-γ和 endostatin 双基因治疗联合放射治疗小鼠转移性乳腺癌的抑瘤作用

1 IFN-和 ENDOSTATIN 双基因治疗联合放 射治疗小鼠转移性乳腺癌的抑瘤作用 作者姓名（排序）：刘林林，张奇，张伟静，T Conere, M Hurley 作者单位：吉林大学第二医院肿瘤生物治疗科 第一作者姓名及身份证号码：刘林林通讯作者姓名：刘林林 一、研究背景 乳腺癌是西方女性中最常见的恶性肿瘤，这些病人中有 30-50% 将会发生转移。外科手术、放射治疗和化疗是治疗 乳腺癌患者最常用的方法。然而这些常规治疗方式并没有 提高局部晚期或者转移性乳腺癌患者的生存率。基因-放射 治疗即基因治疗联合放射治疗通过其不同的抑瘤机制在乳 腺癌治疗中有着广阔的前景。 IFN-由活性T细胞和NK细胞分泌,是第一个由基因工 程生产的治疗癌症的细胞因子。 Endostatin(内皮抑素)不仅被发现是有效力的血管生 成抑制因子，而且被报道在临床前期的肿瘤模型中有明显 的抑瘤效应。 早期反应生长基因1 (Egr-1) 基因可由辐射诱导转录 表达，利用Egr-1 作为启动子，IFN- 和 endostatin的 基因表达可以被辐射诱导加强。 二、材料与方法 1.细胞系和实验动物 小鼠乳腺腺癌细胞系4T1 购自美国 Type Culture Collection (Manassas, VA)公司。 雌性BALB/c小鼠(6-8-周龄，体重 16-20克)购自Harlan(Oxon, U.K.) 2.小鼠转移性乳腺癌模型的建立 小鼠左下腿处乳腺组织注射1105 的4T1 细胞。一周后当小鼠腿部 局部肿瘤生长到直径大约5 mm时，小鼠被随机分为5组。1组为空白对 照组；2组为单纯注射空质粒(20 mg)；3组注射pEgr-IFN- + pEgr- endostatin质粒；4组为单纯局部接受8 Gy 放疗；5组为局部接受8 Gy 放疗联合pEgr-IFN- + pEgr-endostatin 质粒基因治疗组。隔 日用卡尺测量肿瘤大小，21天后杀死小鼠并取转移的肺结节计数。另 一组动物做生存率的实验。 3.ELISA检测细胞培养液上清和肿瘤组织匀浆中 IFN-g 和endostatin 的水平 4. Yac-1 和 4T1 cells 分别被用做评价NK and CTL 细胞毒活性的 靶细胞。其细胞毒效应用Cran ToxiLux 试剂盒检测 (OncoImmunin, Gaithersburg, MD) 5.肿瘤组织中的微血管密度由兔抗鼠-CD31 单抗检测 (BioLegend, San Diego, CA) 并在40倍和200倍的光学显微镜下计数。 三、结 果 1 体外照射不同剂量转染的4T1细胞的IFN- 和 endostatin的表达 如图1所示，2 到 20 Gy不同剂量的X射线照射转染的4T1细胞4小时后，IFN- 和 endostatin的表达呈剂量依赖性上升。(p0.05), IFN-水平在5 Gy照射后达到峰值 (图1A) ，而endostatin水平在10 Gy照射后达到峰值 (图 1B)。 图1A 不同剂量照射后细胞上清中 IFN- 的表达 图1B 不同剂量照射后细胞上清中 endostatin 的表达 2 体外照射不同时间转染的4T1细胞的IFN- 和 endostatin的表达 5 Gy 照射后2, 4, 8, 16, 24, 48, and 72 h ，4T1细胞上清中IFN- 和 endostatin 浓度与对照组比较上升，具有显著的统计学差异(p0.05)。见图 2A和2B。 图2A 5Gy照射后不同时间细胞上清中 IFN- 浓度的表达 图2B 5Gy照射后不同时间细胞上清中 endostatin浓度的表达 3 IFN-和endostatin 基因治疗和放射治疗的抑瘤作用 IFN-和endostatin 基因联合放射治疗组小鼠的肿瘤生长速率和肿瘤/体重比较对照 组明显抑制(p0.05)。此外，基因联合放射治疗组小鼠的肿瘤生长速率和肿瘤/体重 比较单纯基因治疗组(p0.001) 或单纯放疗组 (p0.001) 显著降低。见图3A和3B 图3A 基因放射治疗对肿瘤生长 速率的影响 图3B 基因放射治疗对小鼠肿瘤/体重比的影响 图4 基因放射治疗对小鼠肺转移结节的影响 图4可见，基因联合放射治疗组小鼠的肺结节数较对照组明显降低(p0.01)。 由图5可见，基因联合放射治疗组小鼠的生存率较对照组明显降低(p0.01)。 4 IFN-和endostatin 基因放射治疗对小鼠肺结节和生存率的影响 图5 基因联合放射治疗对小鼠生存率的影响 5 联合IFN-endostatin 基因放射治疗抑瘤作用的机制研究 图6A 基因联合放疗后小鼠脾中CTL细胞活性 IFN-和endostatin 基因联合放射治疗组小鼠脾中的CTL和 NK细胞活性较对照组 显著升高，具有统计学差异(p0.01)。如图6A和6B。 此外，IFN-和endostatin 基因联合放射治疗组小鼠腹腔巨噬细胞的 TNF-a 水平也较对照组显著升高（ p0.05)，见图 6C。 图6B 基因联合放疗后小鼠脾中NK细胞活性图6C 基因联合放疗后小鼠TNT-a细胞活性 6联合IFN-endostatin 基因放射治疗抑瘤作用的机制研究 图7 IFN-和endostatin 基因联合放射治疗对小鼠肿瘤血管密度的影响 如图 7所示， IFN-和endostatin 基因联合放射治疗组小鼠肿瘤血管密 度较对照组显著降低（p0.05)， 四、讨 论 1 在本研究中，我们构建了辐射诱导双基因表达质粒pEgr-IFN- 和 pEgr-endostatin，并且证明了IFN-和endostatin的双基因治疗联 合放射治疗在鼠转移性乳腺癌模型中的协同抑瘤效应。 2 我们在体外实验中观察到了endostatin和IFN-在转染的 4T1 细 胞受到辐射后的表达呈时间和剂量依赖性升高。 3 我们在小鼠转移性乳腺癌体内试验的研究中也发现，基因联合放射 治疗组较对照组、单纯基因治疗组、单纯放射治疗组、空质粒组的抑 瘤作用有显著的统计学差异。此种现象也表现在了乳腺癌的肺转移结 节的抑制作用。同样，我们也发现 IFN-endostatin 双基因治疗 联合放射治疗对荷瘤小鼠有显著的生存受益率。 4 研究发现，基因联合放射治疗组小鼠脾脏 CTL 和 NK的细胞毒活性 明显高于对照组。我们也观察到在基因联合放射治疗组腹膜巨噬细胞 释放的TNF-a 也显著的高于对照组。这些结果提示电离辐射诱导局部 IFN- 的产生能够激活免疫细胞包括巨噬细胞，NK 细胞，和T 细胞 的特异性免疫应答进而增强了抑瘤效应。 5 我们在本研究中发现基因联合放射治疗组肿瘤组织中的血管密度显 著低于对照组，证实了endostatin的抗肿瘤血管生成的作用进而发挥 了其抗肿瘤的作用。 小 结 总之, Endostatin和IFN-双基因治疗联合肿