g蛋白及其受体的研究ppt课件

2016.11.19 G蛋白及其 受体的研究进展 Please Add Your Title In Here please add your title in here GPCR的 概念 GPCR的 分类 GPCRs的 概念 GPCRs的 结构，分 类 GPCR GPCRs 研究进展 讲述步骤 01 GPCR的概念 Please Add Your Title In Here please add your title in here 2. 由，三个不同亚基组成。激 素与激素受体合诱导GTP跟G蛋白结 合的GDP进行交换结果激活位于信 号传导途径中下游的腺苷酸环化 酶。 3. G蛋白将细胞外的第一信使肾上 腺素等激素和细胞内的腺苷酸环 化酶催化的腺苷酸环化生成的第二 信使cAMP联系起来。具有内源GTP 酶活性。 1. G蛋白是指能与鸟嘌呤核苷酸结 合，具有GTP水解酶活性的一类信 号转导蛋白 是细胞信号传导中的重要蛋白质 Please Add Your Title In Here please add your title in here G蛋白的种类已多达40余种， 大多数存在于细胞膜上，由、 、 三个不同亚单位构成，总分子 量为100kDa左右。 GPCR分类 1 2 3 其中亚单位在多数G蛋白中 都 非常类似，分子量36kDa左右。 亚单位分子量在8-11kDa之间，除 Gt外，大多数G蛋白的亚单位都 是相同的。 两个亚单位的不同可以将蛋 白分为Gs、Gi、Go、Gq、G12 及Gt等六类。这些不同类型的G 蛋白在信号传递过程各种发挥不 同的作用 GPCRs的概念02 Please Add Your Title In Here please add your title in here 1. G蛋白偶联受体,是一大类膜蛋白 受体的统称。 2. 这类受体的共同点是其立体结 构中都有七个跨膜螺旋，且其 肽链的C端和连接第5和第6个跨 膜螺旋的胞内环上都有G蛋白 （鸟苷酸结合蛋白）的结合位 点。 3 . 目前为止，研究显示G蛋白 偶联受体只见于真核生物之中， 而 且参与了很多细胞信号转导 过程。 GPCRs的概念 GPCRs的结构 与分类 03 Please Add Your Title In Here please add your title in here 01 G蛋白偶联受体均是膜内在蛋白 每个受体内包含七个螺旋组成 的跨膜结构域，这些结构域将受 体分割为膜外N端，膜内C端， 3个膜外环和3个膜内环。 02 受体的膜外部分经常 带有糖基化修饰。膜外 环上包含有两个高度保 守的半胱氨酸残基，它 们可以通过形成二硫键 稳定受体的空间结构。 GPCRs的结构 Please Add Your Title In Here please add your title in here 01 A 类 (视紫红质样受体) 02 B 类 (分泌素 受体家族) 03 C 类 (代谢型谷氨 酸受体) 04 D 类 (真菌交配信 息素受体) 05 06 E 类 (环腺苷 酸受体) F 类 （Smoothened家 族) 据对人基因组进行序列分析所得的结果人们预测出了近千种G蛋白耦联受体的基因。 这些G蛋白耦联受体可以被划分为六个类型，分属其 中G蛋白耦联受体的基因序列之间没有同源关系。 GPCRs的分类 04 GPCR GPCRs研究进展 Please Add Your Title In Here please add your title in here B Lefkowitz采用放射性标记的方法标 记了糖皮质激素和肾上腺素，证明 了受体独立于腺苷酸环化酶（AC） 的存在 1968年到1971年间， A C Lefkowitz和Kobilka的工作从根本上改 变了人类对GPCR受体和跨膜信号传递的 认识，对现代药物设计的方式有重要影 响。 Kobilka第一次将光能感应和激素感应的受 体直接联系起来 上世纪80年代， GPCR被发现的历史 Lefkowitz通过同位素标记的配体结 合等实验提出配体-受体-效应器相互作 用的三级复合物模型。 Lefkowitz 2011年第一次在 原子分辨率阐明了 GPCR参与信号转导的机制 1 、 标记并分离纯化扩散型配体 的GPCR 2、 肾上腺素受体扩散型配体 的GPCR的基因克隆 3 、 GPCR工作机制研究 3 GPCR工作机制研究 方法 Please Add Your Title In Here please add your title in here 01 Lefkowitz使用去污剂显著提、 高了b2肾上腺素能受体蛋白 的可溶性，并在此基础上首 次制作了亲和层析柱，将琼 脂糖的侧链上人工加入一个 长度为30-A的糖链，并通过 该链将琼脂糖与去甲肾上腺 素偶联 1972年 02 再度改进了b2肾上腺素能受 体蛋白的纯化方法，他们使 用拮抗剂异丙肾上腺素偶联 的琼脂糖作为介质制作亲和 层析柱，建立了更加便捷有 效的纯化方法，该方法适合 大规模纯化受体蛋白 1979年 03 他们把纯化后的可与肾上腺 素结合的细胞表面蛋白导入 不响应肾上腺素的细胞后， 发现细胞的表现与具有肾上 腺素受体的细胞一致这项实 验结果使人们真正相信了细 胞表面受体的独存在。 几年后， 04 随后Lefkowitz实验室克隆的GPCR 标记并分离纯化扩散型配体的GPCR 诺贝尔奖得主 Please Add Your Title In Here please add your title in here 3 诺贝尔奖得主罗伯特莱夫科维茨 1 2 1 2 b2肾上腺素能受体 异丙肾上腺素 Lefkowitz Please Add Your Title In Here please add your title in here B Lefkowitz实验室首次成功克隆了编码仓 鼠b2肾上腺素能受体蛋白的基因并进行了 测序分析对编码基因的序列的分析发现， b2AR与牛“光受体”视紫质蛋白的氨基 酸序列具有显著相似性，二者都具有7次 跨膜的区域 1986年 A C Lefkowitz和Kobilka很快推断出 “光受体”视紫质蛋白和b2AR可能属于 同一家族，这一家族可能编码很多重要的 激素受体。这一工作旋即被毒蕈硷乙酰胆 碱受体的克隆所证实 上世纪80年代， 肾上腺素受体扩散型配体的GPCR的 基因克隆 基于这一推论，Lefkowitz，Kobilka等 人很快成功克隆了编码人类b2肾上腺素 受体蛋白的cDNA，编码人类b1肾上腺 素受体、人类血小板2肾上腺素受体、5 -羟色胺受体以及第一个孤儿受体等在内 的一系列受体的基因 工作中得到的信息和技术也帮助了嗅觉受 体这一超家族的发现和克隆 Please Add Your Title In Here please add your title in here 随后 Kobilka研究组解析 了结合激动剂的处于 活性状态的人beta2 肾上腺素受体的结构 解析G-2 肾上腺素受体复合物 的结构，完整解释了 GPCRs如何被配体激 活以及再激活下游G 蛋白从而传递信号的 过程。 诺贝尔奖得主布莱恩-科比尔卡 2001 2007 2007年，Kobilka利用T4溶菌酶 融合蛋白方法解析了第一个非 视紫红质GPCR晶体结构：人 beta2肾上腺素受体，他还独立 地通过抗体片段介导法解析了 人beta2肾上腺素受体的结构。 Please Add Your Title In Here please add your title in here 01 20世纪60年代Sutherland发现cAMP介 导激素引起的细胞响应，于1971年获得 诺贝尔奖，1986年Gilman分离纯化得到 了G蛋白，并获得了1993年诺贝尔奖， 02 除以上信号机制以外，Lefkowitz实 验室和一些其他实验室也对 GPCR的工作机制研究中做了重要 贡献，包括提出并发展三元复合物 模型，阐明受体磷酸化和脱敏机制 ， 以及独立于G蛋白的b -抑制蛋白介 导的信号转导系统等。 GPCR工作机制研究 Please Add Your Title In Here please add your title in here . 1. 中国科学院生物物理所的王江云 课题组和山东大学医学院的孙金 课题组于2015年9月8号在权威 期 刊Nature communications上发 表了研究论文，报道了他们应用 最新的非天然氨基酸编码技术， 揭示了G蛋白偶联受体重要的信 号转导机制的详细过程 研究GPCR,GPCRs的新发现 2. 研究 GPCRs 与 G 蛋白相互作用的传 统技术包 括免疫共沉淀、免疫共定位、 GST 融合蛋白沉降等， 这些技术自身存 在一定的不足，无法满足在生理条 件下 检测受体或蛋白的相互作用。 而BRET、TIRF 及 FRET 等相关技术的 出现解决了这一难题，它们 可以实时、 动态、连续地监测生理状态下受体-受体 、 受体 -G 蛋白间的动力学关系，并且 不会对细胞造 成损伤，这为受体与 G 蛋 白相互作用的动力学研究 提供了更加便 利、准确的研究手段。 Please Add Your Title In Here please add your title in here 2007 年 Vadim Cherezov 等采用缺失 （或点） 突变结合融合蛋白技术解析出 了第一个人 肾 上腺素受体 2 的精细结 构. 他们采用突变技术。 研究GPCR,GPCRs的新发现 1 2 3 获得第一 个人 GPCR 的精细结构，也是第 2 个 GPCR 的高 分辨率晶体结构，该结果 被 Science 杂志评为 2007 年十大科技进展 之一. 2008 年 5 月 Midori Murakami1 和 Tsutomu Kouyama 等报道了从乌贼视细胞中 分离得到的 Rhodopsin 的精细结构，分辨率 达 3.7 A，它与牛 Rhodopsin 结 构 基 本 相 似 主 要 区 别 在 于 牛 Rhodopsin 的 N 末 端 为 无 规 卷 曲 ， 而 乌 贼 Rhodopsin 的 N 末端 形成了规则的 螺旋结构， 这可能与其生 活的海洋环境有密切关系. 2008 年 7 月 Tony Warne 等采用缺失 突变 的方法，将火鸡 1 肾上腺素受体中 不稳定的氨基 酸进行点突变， 同时将较长的 N 末端、C 末端以 及胞内 loop 进行缺失突变，降低其柔性，增加了 稳定性，最终获得了该突变体 2.7 A的精 细结构. Please Add Your Title In Here please add your title in here 2008 年 11 月 Veli-Pekka Jaakola 等 采用类 似的方法，将人 A2A 腺 苷受体的胞内第 3 个 loop 与 T4 溶菌酶 相融合，同时删去该 loop 和 C 末端大部 分柔性片断. 为了稳定 A2A-T4L-C， 在 纯化过程中需要同时加入： 研究GPCR,GPCRs的新发现 1 2 1）胆酸钠；2）饱和 剂量的受体拮抗剂 ZM241385；3） 胆固醇琥珀酸 单酯. 最终获得 了该突变体（A2A-T4L-C）与拮 抗剂 ZM241385 复合体 2.6 魡 的晶体结构，这也 是第二个人 GPCR 的高分辨率晶体结构. 除了上述两个天然分离的 Rhodopsin 的结构 外，另外 3 个重组表达得到的 GPCR 晶体结 构 （见表 ）也为我们提供了两条可能获得 GPCR 高 分辨率晶体结构的方法，即融合蛋 白法和缺失突 变法. 尽管二者都对原始蛋白进行了结构改造 ， 这样获得的晶体结构可能会与其实际 结