专业分析第一章绪论 ppt课件

专业分析 Date 第一章 绪论 第二章 水分测定 第三章 酸的测定 第四章 碳水化合物测定 第五章 蛋白质及氨基酸的测定 第六章 物理分析法 第七章 仪器分析法 Date 第一章 绪论 1.1 课程性质、目的、内容和要求 1.2样品采集、处理与保存 1.3分析方法的选择 1.4分析误差与数据处理 Date 1.1 课程性质、内容、目的和要求 课程性质：专业基础课，专门研究与生 物工程有关的物质成分定性和定量分析 理论和实际操作技能的一门学科 Date 生物工程：对象、运用技术平台、产品 对象：微生物、植物、动物细胞 技术平台：生长（试管、摇瓶、罐）、代谢（ 生化途径及基质消耗、中间产物的生成检测） 、达到产品合成（最优化及检测） 专业分析是生物工程基础之一 Date 课程目的和任务： 通过学习和操作性能的训练，学会对不同检测 项目选用适当的分析方法， 掌握经典的化学组分的物理、化学分析原理和 操作要点，掌握常用分析仪器的工作原理、构 造、性能、使用方法及其维护知识， 能独立运用物理、化学和常用仪器分析方法， 对生物工程工业生产和科研中有关原料、半成 品、成品、副产品和其它样品进行测定， 培养正确判断和表达专业分析结果的能力。同 时培养初步的科学研究的能力。 Date 主要内容是分析方法和仪器分析方法， 包括样品的采集处理、数据处理记录、生物 样品的酸度、碳水化合物、氨基酸和蛋白质 的物理分析方法、化学分析方法和包括大部 分生物样品的组分的仪器分析方法的原理和 实际操作要点。 课程内容 为什么要检测这些内容？ Date 要求： （1）掌握生物工程样品分析的基本知识，熟悉各种基本概念、名 词和术语，并正确理解它们的意义及应用范围； （2）掌握样品的采集、制备、处理与保存的一般方法； （3）掌握生物工程样品主要成分的分析原理和基本操作技术； （4）通过实验了解分析的方法、操作技术、仪器设备的使用方法 。 （5）培养正确观察、记录实验现象和处理数据，正确运算和表达 结果并能写出正确的实验报告，从而进一步提高生产和科学研 究中分析和解决问题的能力。 Date 专业分析对象 蛋白质、氨基酸 碳水化合物（还原糖、总糖、淀粉、纤维 ） 矿物质、灰份（常量元素、微量元素） 水分 总酸和有机酸 Date 常用的分析方法 采用的方法主要有： 感官检测法；化学分析法； 仪器分析法； 微生物分析法；酶分析法 Date 化学分析法 化学分析法是以物质的化学反应为基础，使被测组分在溶液中 与试剂作用，由生成物的量或消耗试剂的量来确定组分和含 量的方法。 主要有重量法和容量法 重量法:水分 灰份 脂肪 纤维 果胶 容量法: 酸碱滴定: 酸度 蛋白质 氧化还原滴定: Vc 沉淀滴定: Cl 络合滴定: Ca 2+ 即使是仪器分析也是以化学分析法为基础的，化学分析是最基 本的分析方法 Date 仪器分析法 仪器分析法使用较特殊的仪器测量物质的物理性质故称仪器 分析法，仪器分析法具有灵敏、快速、操作简单，易于实 现自动化等优点 它包括物理分析法和物理化学分析法 1）物理分析法是通过测定密度、粘度、折光率、旋光度等物 质特有的物理性质来求出被测组分含量的方法。 2） 物理化学分析法是通过测定物质的光学性质、电化学性 质等物理化学性质 求被测组分含量的方法 分为：光学分析法、电化学分析法、色谱分析法、质谱分析 法等，常用的为前三种 Date 物理化学分析法包括: 光学分析法： 紫外可见光分光光度法芳香化合物、蛋白质、核酸 原子吸收分光光度法 大部分元素 荧光分析法 维生素 红外光谱法 氨基酸 电化学分析法 电位分析（pH分析、离子选择性电极 分析）、电导分析（溶液中的离子浓度：水的纯度 糖品灰 分），电容量分析（如电位滴定) 色谱分析法 薄层色谱 有机酸 黄曲霉素 气相色谱 小分子的氨基酸、脂肪酸 高效液相 维生素 糖类 农药残留 质谱分析和色质联用分析 Date 酶分析法 利用酶的反应进行物质定性、定量分析方 法，具有高效、专一性强，条件温和的 特点 可测有机酸、糖类、淀粉、Vc等 以上几种方法 并非决然分开 而是有的 综合运用 Date 分析的一般程序 1、样品的采集制备和保存 2、样品的预处理 3、成分分析 4、分析数据处理 5、分析报告的撰写 Date 1.2 样品采集、处理与保存 是分析检验的第一步，是正确分析的一个 重要环节 一、样品的采集 二、样品的制备 三、样品的保存 四、样品的预处理 Date 需遵守的原则：代表性、采用方法与目的的一致性、原有理化指标 的完整性。 代表性：反应生化过程各个时期的特点，即周期取样 采样与目的一致：如非生物活性材料取样（发酵上清、生物量、pH 等）取样后可以一般冻存；而活性材料（如检测酶活性）需要保 持细胞在取样时的代谢状态，因此需要液氮保存。 原有理化指标一致性：也即是保持细胞在取样时的代谢状态，取样 后未合适保存，微生物代谢状态发生变化，此样非彼样。 一、样品采集 Date 采样方法 随机抽样及其特点：随机原则，可避免人为倾向性 代表性取样及其特点：时间空间变化规律、代表性 通常采用两种方法结合的方式 采样数量 数量的确定要考虑分析项目的要求、分析方法的要求及被 检物的均匀程度 样品（指平均样品）一式三份，分别供检验、复验和被查 采样注意事项 1、一切采样器、容器保持清洁，防止将非样品物带入样品中 2、设法保持样品原有微生物状况和理化指标(不污染,变化) 3、易变化的样品,应及时分析检验 4、样品器具上应贴标签表明名称、日期、地点、批号 Date 二、样品保存 1、一般情况下,即时分析 。不能马上测试的样品 ，应正确保存以防止水分、挥发性成分散失,防 止待测组分含量发生变化（如分解,发酵等）。 2、洁净,密封,阴暗处保存 易腐败变质的样品应保存在0-5 冰箱， 易发生光解的需避光保存(VB1 、胡萝卜素、 黄曲霉B1) 3、存放样品,按日期,批号,编号摆放,以便查找 Date 三、样品的预处理 对待测样品进行分离、掩蔽,以排除干扰组分，进行浓缩处理 以提高待测成分含量的操作过程称为样品的预处理。 样品预处理的目的：发酵样品成分复杂，往往以复杂的结合态 存在,造成对检测的影响；有的样品待测成分含量过低，必须 进行浓缩处理提高含量；有的样品则需要去除杂质 预处理过程排除干扰因素,完整保留被测组分,以获得 理想测定结果，所以样品的预处理是发酵分析过程中 的重要环节 预处理的方法有6种：有机物破坏法、溶剂提取法、蒸 馏法、色层分离法、化学分离法、浓缩法。 应根据分析对象、被测组分理化性质、含量及分析方 法，确定预处理方法。 如：HPLC检测蛋白的去除 Date （一）有机物破坏法 通过高温或高温加强氧化条件使有机物分解，使被有机物结 合的待测成分转化为无机物状态的成分，主要用于测定食品中 除汞以外的金属元素及部分非金属元素, 分干法和湿法预处理 1、 干法预处理-灼烧法 （1）原理： 样品 在坩埚加热脱水，炭化，分解，氧化灰化(高温电 炉500 -550灼烧) 白(灰)色残渣(得到无机成分) 提高准确度的措施 采取适宜的灰化温度(降低温度) 采用低温灰化技术，在150度以下即可使样品灰化 加入助灰化剂，防止挥发损失和坩埚吸留 如: 加入 氯化镁或硝酸镁可使磷、硫元素转变为难挥发的磷酸 镁和硫酸镁，加入氢氧化钠或氢氧化钙可使卤素转变为难挥 发的钠和钙盐 Date 2、湿法消化 简称消化法 （1）原理 加入浓硝酸、浓硫酸、HClO4 、KMnO4、 H2O2 等强氧化剂,加热消化使有机物分解氧化,以气 态挥发，而待测组分以无机物状态存在于消化液中 。是常用的方法 （2）消化法的特点 有机物分解速度快,时间短 温度低, 挥发少 ,吸留少 产生有害气体,需通风柜中进行 消化初期,易产生大量泡沫 （3）常用方法包括硝酸高氯酸硫酸法、硝酸 硫酸法 Date （二）溶剂提取法 利用各组分在某一溶剂中溶解度的差异，将各组分分 离的方法，又称溶剂萃取法。常用于测定维生素,重 金属,农药残留,黄曲霉毒素 1、 溶剂的选择 根据:相似相溶”原则,选择溶剂 极性弱成分(有机氯农药) 极性小的溶剂(正乙烷,石油醚) 极性强成分(黄曲霉毒素B1) 极性大溶剂(甲醇,乙醇,水) 溶剂沸点 45 - 80 为宜，利于挥发和浓缩 溶剂惰性,不与样品发生反应 Date 2、提取方法 提取方法可归纳为三种：浸提法、溶剂分层法 、 （1）浸提法 ：将(固体如离心后的湿菌体)样品放入 溶剂中浸泡,使被测组分溶于溶剂中,分为震荡法和 捣碎法。前者为将样品切碎用溶剂浸泡，回收率较 低；后者将样品与溶剂用捣碎机共同捣碎一段时间 的方法，回收率高，但杂质也高 Date （四）色层分离法 色层分离法又称色谱分离法。根据原理不同,可分为: 吸附色谱分离、分配色谱分离、离子交换色谱分离 1、吸附色谱分离 用吸附剂选择性的吸附被测成分或干扰成分，常 用吸附剂有硅藻土、硅胶、氧化铝、聚酰胺，如 聚酰 胺吸附色素 2、分配色谱分离 根据不同物质在固定相和流动相间的分配比不同 而进行分离的方法，如多糖类物质的酸水解后的纸层 析，定性检测和分离 3、离子交换色谱分离 利用离子交换剂与溶剂中离子间所发生的交换反 应来进行的分离方法 Date （五）化学分离法 1、沉淀分离法 利用沉淀反应进行分离的方法。在试样中加入沉 淀剂,使被测组分或干扰成分沉淀下来,经过滤或离 心分离。 例如,测纯蛋白,可加入重金属,使蛋白质下降,再测 其沉淀的氮量，或者加入的重金属使蛋白质沉淀， 使待测物质留在溶液中。 2、掩蔽法 利用掩蔽剂与干扰成分作用,使干扰成分转变为不 干扰测定状态。利用这种方法,可不经分离干扰成分 ，,简化了分析步骤。 如Cu 2 Cd 2等离子对铅的 测定有干扰，可采用加入氰化钾和柠檬酸铵掩蔽。 Date 1.3 分析方法的选择 一、选择方法应考虑的因素 二、精密度及其表示 三、准确度及表示 四、灵敏度 Date 选择正确的分析方法是保证分析准确的关键环节 一、选择方法应考虑的因素： 分析要求的准确度和精密度 分析方法的繁简和速度 样品特性如形态、含量及干扰物的影响程度 现有条件 如长链脂肪酸和挥发性脂肪酸的检测 评价一个分析方法时，常用精密度、准确度和灵 敏度三项指标 Date 二、精密度及其表示 指多次平行测定结果相互接近程度，代表测定 方法的稳定性及重现性，测定结果差异来自偶 然误差，精密度高低可用偏差表示： 绝对偏差：测定结果与平均值之差，d 相对偏差：绝对偏差占平均值的百分比 分析结果的精密度常用平均偏差和标准偏差表示 Date 1. 平均偏差 平均偏差又称算术平均偏差， 用来表示一组数据的精密度。 平均偏差： 特点：简单； 缺点：大偏差得不到应有反映。 Date 2. 标准偏差 相对标准偏差称为变异系数 相对标准偏差 ：（变异系数）CV% = S / X 标准偏差又称均方根偏差； 标准偏差 ： Date 三、准确度及表示 指测定值与真实值的接近程度，主要由系统误 差决定，反映测定结果的可靠性。 准确度高的方法其精密度必然高，但相反则不 一定。 准确度可用误差表示，误差小，则准确度高 误差分为绝对误差与相对误差，绝对误差指测 定结果与真实值之差，而相对误差指绝对误差 占真实值的百分率。 精密度:指多次平行测定结果相互接近程度，代表测定方法的稳定 性及重现性，测定结果差异来自偶然误差， Date 四、灵敏度 指分析方法所能检测到的最低限量。 不同方法有不同灵敏度，一般仪器分析 法高于化学分析法 Date 1.4 定量分析中的误差与数据处理 一、误差的来源 二、控制和消除误差的方法 三、分析数据的处理 四、实验数据的处理 * 误差的来源 真实值 测定值 误差：测定值与真实值的差异，分为系 统误差和偶然误差 Date 系统误差 由固定原因造成的误差，在测定过程中 按一定规律重复出现，有方向性即偏高 或偏低 系统误差大小是可测的，来源于分析方 法、仪器、试剂和主观认识（对操作规 程和操作条件等因素）引起的误差 Date 偶然误差 由于偶然外因引起的误差，产生的原因 不固定、大小不一，或正或负；可能是 由环境（气压、温度、湿度）变动或仪 器性能、分析人员对各个样品处理不一 致造成。 Date 控制和消除误差的方法 1. 正确选择样品量 2. 增加平行测定次数，减少偶然误差 对照试验:与标准试样的标准结果进行对照; 2. 实验数据的处理 可疑值的取舍 同一个样品多次测定的结果中，个别数据与其它数据 相差较大时，对这些极端数据不可随意丢弃 应有足够的理由认为是由于操作失误或干扰引起的， 则可剔除，否则应依据误差理论决定取舍，方法包括 ：4d法、格鲁布斯(Grubbs)法、Q值确定法 Date （1）4d法 求异常值之外的各数据的平均值 求异常值之外的各数据对平均值 的差的平均 值，即平均偏差 。 计算异常值与 的差值 求 比值，若大于4则舍去，否则保留。 当4d法与其他检验法矛盾时，以其他法则 为准。 异常值xD Date 例 测定某药物中钴的含量如(g/g),得结果如下： 1.25，1.27，1.31，1.40。试问1.40这个数据是否 应保留? 解 首先不计异常值1.40，求得其余数据的平均值 和平均偏差为 异常值与平均值的差的绝对值为 |1.40一1.28|=0.124 (0.092) 故1.40这一数据应舍去。 Date （2）格鲁布斯(Grubs)法 有一组数据，从小到大排列为: x1,x2,xn-1,xn 其中x1或xn可能是异常值。 用格鲁布斯法判断时，首先计算出该组数据的平 均值及标准偏差，再根据统计参数G进行判断(G 是 和n的函数)。 若GTa,n ，则异常值应舍去，否则应保留 =1-置信水平 n样品个数 Date Date 例 前一例中的实验数据，用格鲁布斯法判断时， 1.40这个数据应保留否(置信度95%)? 解: 各样的平均值 x=1.31，标准偏差 s=0.066 查表T005，4=1.46，TQ表时，异常值应舍去，否则应予保留。分 析化学中通常取0.90的置信度。 Date 1.25，1.27，1.31，1.40 Date 例：测定某一热交换器水垢中的Fe2O3百分含量，进行7次平行测定 ，经校正系统误差后，其数据为79.58，79.45，79.47，79.50， 79.62，79.38和79.80。 解：数据中79.80与其余6个数据相差较大，现根据Q检验决定其取 舍。 已知n=7时，Q0.90=0.51,所以79.80应予保留。 Date 3. 标准曲线绘制 光度法及色谱法分析中，常需绘制标准曲线 ，但在绘制时，常出现1至2个点偏离的情况 ，此时线性拟合Excell程序。 Date 思考题 分析方法选择遵循的原则是什么？ 精密度、准确度和灵敏度对分析方法评价的意 义是什么？ 系统误差和偶然误差的来源是什么？ 控制和消除误差的方法有哪些？ 数据计算时有效位数保留原则是什么？实验数 据中可疑值如何取舍？ Date 分批培养中柠檬酸钠对苏云金素 生物合成的调控作用 应用举例 Date 苏云金素与聚3-羟基丁酸的代谢关系 苏云金素与腺嘌呤从头合成途径 有关，因而与糖酵解、三羧酸循 环有密切关系。 苏云金素与PHB位于碳中心代谢 途径的不同方向，两者的合成属 于碳源的竞争关系。因此，碳代 谢流在代谢网络中的分配，将会 影响两者的合成。 减少PHB的合成量可能会提高苏 云金素产量和对底物的转化率。 Date 本实验采用细胞破碎 后氯仿萃取UV吸收法 检测胞内PHB。 PHB的回收率在98%- 103%，相对标准偏差 在1-2.0%之间。满足 光谱法测定的准确性 和重复性要求。 4.3.1 紫外分光光度法检测PHB的回收率和相对标准偏差 Date 3 h-21 h糖消耗很快 ，生物量迅速增加。 苏云金素在9 h时开 始合成。21 h后葡萄 糖消耗与菌体生长缓 慢，但苏云金素仍在 继续合成。PHB伴随 菌体生长而合成， 24hPHB含量为菌体 干重的16.0。 4.3.2 苏云金素与PHB生物合成的代谢关系 Date 有机酸检测显示 ：12 h时，乙酸 谷氨酸含量达到 峰值，随后降低 。这与pH值趋 势一致。 Date 苏云金素与PHB同期合成，合 成PHB会减少苏云金素合 成的碳骨架供量。 柠檬酸钠分批培养添加实验， 如图4.4：2.0 g/L的柠檬酸 钠添加量提高苏云金素产量 56.0；PHB含量比对照低 30.0。出于工业化生产考 虑，在3.0 L罐水平进行分 批培养重复试验。 Date 1. 生物量与菌体对葡萄糖 得率没有差别。 2. pH值变化的差异很大 ： 添加柠檬酸钠后，菌体代 谢状态发生改变。 Date 9h有机酸达峰值 。乙酸与丙酮酸 浓度比对照降低 50.0-66.0； 谷