hela细胞中hcv ns5a的表达对干扰素敏感病毒vsv复制的影响(1)

HeLaHeLa 细胞中细胞中 HCVHCV NS5ANS5A 的表达对干扰素的表达对干扰素 敏感病毒敏感病毒 VSVVSV 复制的影响复制的影响(1)(1) 作者：廖继佩，薛小平，尹文，雷迎峰，吕欣，杨敬， 徐志凯 【关键词】丙型肝炎病毒 EffectofHCVNS5AexpressioninHeLacellsoninterferonsen sitivevirusVSVreplication 【Abstract】AIM:TodemonstratetheeffectofHCVNS5Aexpr essiononvesicularstomatitisvirus（VSV） replication.METHODS:Stablytransfectedcellswerecultu redperwellina6welltissuecultureplateandculturedfor2 4h.HumanrecombinantIFN2awasthenaddedatvariousconc entrationsfor24htoinducetheIFNantiviralstate.Infect ionwithVSVwasthenperformedandsupernatantswereharves tedatvarioustimepointsafterinfection.Changesininfec tiousvirusyieldsweremeasuredbyastandardvirusplaquea ssayinVerocells.RESULTS:WhentheIFNconcentrationwas1 105U/L,HeLaNS5AcellsinfectedwithVSVhadmoreobvious cytopathiceffectcomparedwiththatofHeLaNS5AISDRcel ls.InthevariousconcentrationtreatmentsofIFN,theviru stitersinthesupernatantofHeLaNS5Acellswereabout2to5 timesthoseofHeLaNS5AISDRcells.CONCLUSION:NS5Aexpr essionrescuesVSVreplicationduringIFNtreatmentandthi seffectisdependentontheputativeinterferonsensitivit ydeterminingregion.Thiseffectwillbehelpfultodemonst ratethatHCVcannaturallyevadetheIFNinducedantiviralr esponseinpersistentlyinfectedpatients. 【Keywords】hepatitisCvirus;nonstructuralprotein5A; interferonsensitivitydeterminingregion;vesicularsto matitisvirus;plaqueformingunit 【摘要】目的：研究丙型肝炎病毒（HCV）NS5A 的表达 对水泡性口炎病毒复制的影响.方法：将稳定转染的 HeLaNS5A 和 HeLaNS5AISDR 细胞在 6 孔培养板中培养 24h 后，加入人基因工程 2a 型干扰素至所需浓度.培养 24h 后加入 VSV，继续培养相应时间.取培养上清液，按 10-1 稀 释，50L 稀释液加入含 Vero 细胞的 24 孔培养板中.每孔 加入含 100mL/L 小牛血清的 g/L 羧甲基纤维素钠 1mL.继续 培养 48h 后移走培养液，结晶紫染色，自来水轻柔洗净， 记录噬斑形成单位.结果：干扰素浓度为 1105U/L，VSV 对 HeLaNS5A 细胞的致病变作用要比对 HeLaNS5AISDR 细 胞的致病作用更明显.在整个 IFN 浓度处理中，HeLaNS5A 细 胞培养液中的病毒滴度是 HeLaNS5AISDR 细胞培养液中的 病毒滴度的 25 倍.结论：NS5A 能增强 IFN 敏感病毒的复制， HCVNS5A 内的 ISDR 可能是造成 IFN 对 HCV 患者治疗效果的 因素. 【关键词】丙型肝炎病毒;非结构蛋白 5A;干扰素敏感 决定区;水泡性口炎病毒;空斑形成单位 0 引言 干扰素是目前治疗丙型肝炎最有效的药物，但治愈率 不到 30%.有人认为，NS5A 内存在干扰素敏感决定区，影响 IFN 的抗病毒疗效.在临床研究中，丙型肝炎病毒 NS5A 对 IFN 抗病毒治疗具有固有抗性的观点仍有争论.NS5A 可利用 所谓的 ISDR 外的序列来干扰或逃避 IFN 诱导的抗病毒效应,宿 主介导的压力选择主要作用在 NS5A 的 C 端1 ，但是 Mangoni 等2认为 ISDR 的上游变异性与 IFN 治疗应答有 关.另外，NS5A 可能与 2,5寡腺苷酸合成酶相互作用， 以 ISDR 非依赖机制抑制 IFN 的抗病毒活性3.为了进一 步探明 HCVNS5A 中是否存在影响 IFN 治疗的结构域，在已 经成功构建的稳定转染 HeLaNS5A 和 HeLaNS5AISDR 细胞 系的基础上，我们利用对 IFN 敏感的病毒水泡性口炎病毒， 在 IFN 存在的条件下通过对比分析 VSV 在这两株细胞系中 复制的差异，探讨 HCVNS5AISDR 与 IFN 疗效的相关性. 1 材料和方法 材料 稳定转染的 HeLaNS5A 和 HeLaNS5AISDR 细胞系由第 四军医大学基础部微生物学教研室构建;VSV 病毒由第四军 医大学生物技术中心提供;Vero 细胞由本室保存;胰蛋白酶 购于宝生物工程有限公司;DMEM 和 HEPES 购自 Invitrogen 公司;结晶紫购自湖南化学试剂公司;羧甲基纤维素钠购自 天津市科密化学试剂开发中心;小牛血清购于中美合资兰州 民海生物工程有限公司;人基因工程 2a 型干扰素购自第 四军医大学生物技术中心. 方法 称取 gCMC，溶于 100mL 三蒸水中，高压灭菌.将配好的 100mL2DMEM 移入盛有 100mL15g/LCMC 的玻璃瓶中混匀， 然后加入 22mL 小牛血清，此即为含 100mg/L 小牛血清的 g/LCMC 溶液.称取 5g 结晶紫，溶于 100mL 无水乙醇，此即 为 50g/L 结晶紫贮存液.待使用时移取 50g/L 结晶紫贮存液 8mL，g/LNaCl30mL，甲醛 2mL，混匀后即为 10g/L 结晶紫染 色液.将 IFN 加入培养上清液至终浓度为 1105U/L，培养 24h 后，按感染复数=1 加入相应体积的 VSV 病毒贮存液.继 续培养 36h 后在倒置显微镜下观察 VSV 对稳定转染的 HeLaNS5A 和 HeLaNS5AISDR 细胞形态的影响.在 6 孔培养 板中每孔加入稳定转染的 HeLaNS5A 和 HeLaNS5AISDR 细 胞 5105 个.培养 24h 后，加入 rHuIFN2a.培养 24h 后按 MOI=1 加入 VSV，继续培养 24h 和 36h.取培养上清液稀释成 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，取 50L 稀释液加入 24 孔培养板中，每一处理均做 3 个平行孔.其 中，24 孔培养板中每孔已加入 5104 个 Vero 细胞，并已 培养了 24h.将 24 孔培养板中放入 37,50mL/LCO2 的孵箱 中以利于 VSV 吸附在 Vero 细胞上，平衡吸附 1h 后，将上 层液移走，每孔加入 100mL/L 小牛血清 g/LCMC1mL.继续培 养 48h.将 24 孔培养板中的培养液小心移走，PBS 洗 2 次， 10g/L 结晶紫染色 20min，弃染色液，用自来水轻柔洗净， 颜色较浅或白色的即为 PFU，记录 PFU 值.在 6 孔培养板中 加入 HeLaNS5A 和 HeLaNS5AISDR 细胞 5105