epo对铁调节蛋白hepcidin表达影响的研究(1)

EPOEPO 对铁调节蛋白对铁调节蛋白 HepcidinHepcidin 表达影响的表达影响的 研究研究(1)(1) 作者：孙雪峰，周道斌，赵永强 【摘要】 本研究探讨红细胞生成素（EPO）在正常 小鼠、急性炎症小鼠和慢性病性贫血（ACD）小鼠模型中对 hepcidinmRNA 表达的影响。通过小鼠背部皮下双肩胛骨间 脂肪垫内注射松节油的方法建立急性炎症模型和 ACD 模型。 正常小鼠、急性炎症期小鼠和 ACD 小鼠腹腔注射 EPO 后用 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）半定量法检测肝脏 hepcidinmRNA 的表达水平。结果显示，长期慢性炎症并未 使小鼠肝脏 hepcidinmRNA 表达显著升高，但单次注射松节 油可以使小鼠肝脏 hepcidinmRNA 水平一过性显著升高。腹 腔注射 EPO 能够抑制正常小鼠、ACD 小鼠与急性炎症小鼠肝 脏 hepcidinmRNA 的表达。ACD 小鼠在注射 EPO 后血红蛋白 水平与肝脏 hepcidinmRNA 表达水平呈线性负相关。结论： 皮下多次注射松节油可以建立 ACD 模型。在 ACD 发病过程 早期肝脏 hepcidinmRNA 升高，在此之后恢复正常。EPO 在 正常条件、急性炎症条件和慢性炎症条件下均可抑制 hepcidinmRNA 的表达。 【关键词】慢性病性贫血；hepcidin；红细胞生成素； 铁代谢 AnIronRegulatorHepcidinIsAffectedbyEPO AbstractToinvestigatetheeffectofEPOonhepcidinmRNAex pressioninnormalmice，acuteinflammatorymiceandACDmi ce，theacutephasemodelandACDmodelofmousewasproduced bysubcutaneousinjectionofturpentineoil.Hepatichepci dinmRNAexpressionlevelsofnormalmice，acuteinflammat orymiceandACDmiceweredetectedbysemi- quantitativeretro- transcriptasepolymerasechainreactionafterintra- peritonealinjectionofEPO.Theresultsshowedthatprolon gedchronicinflammationdidnotsignificantlyincreasemo usehepatichepcidinmRNAexpression，butasingleinjecti onofturpentineoilincreasedmousehepatichepcidinmRNAe xpressiontransiently.Intra- peritonealinjectionofEPOdown- regulatedhepatichepcidinmRNAexpressioninnormalmice ，ACDmice andacuteinflammatorymice.Hblevelshadanegativecorrel ationwithhepatichepcidinmRNAexpressionlevelsinACDmi cetreatedwithEPO.ItisconcludedthattheACDmodelcanbep roducedbyrepeatedsubcutaneousinjectionofturpentineo il.HepatichepcidinmRNAexpressionincreasedduringthee arlyperiodofACDprocessandthenfalltonormallevel.EPOd own- regulatehepcidinmRNAexpressionunderthenormal，acute inflammationandchronicinflammationconditions. Keywordsanemiainchronicdisease;hepcidin;erythropoie tin;ironmetabolism Hepcidin 是新近发现的一个由肝脏合成的小分子肽， 它通过减少小肠对铁的吸收以及减少网状内皮系统对铁的 释放负性调节铁代谢平衡，可能在铁代谢中起到核心调节 作用。慢性病性贫血（anemiaofchronicdisease，ACD）是 常见的临床综合症之一，多伴发于感染、关节炎、恶性肿 瘤或者创伤等慢性疾病。临床发现，患有 hepcidin 大腺瘤 的患者表现为与 ACD 相类似的贫血，而当腺瘤切除后，贫 血可以自发恢复正常1，2 。这表明 hepcidin 的过度表 达可以引起贫血。肝脏合成 hepcidin 增多时的铁代谢异常 与 ACD 中的铁代谢异常非常相似，提示 hepcidin 在 ACD 发 病中可能起重要作用。EPO 在临床上广泛应用于 ACD 的治疗， 但其作用机理始终未能完全明了。 本实验旨在通过检测急性炎症期小鼠与 ACD 小鼠 hepcidin 表达水平的变化情况，研究 hepcidin 与 ACD 发病 之间的联系；同时通过观测 EPO 在正常条件、急性炎症条 件以及 ACD 条件下对 hepcidin 影响程度的差异，试图解释 EPO 调节 hepcidin 可能的途径。 材料和方法 动物 C57BL/6N 小鼠，雄性，6-7 周龄，体重 18-20g，购自 北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于 SPF 环境。 同批小鼠随机分组。 主要试剂及仪器 利血宝（rhEPO）由麒麟鲲鹏（中国）生物药业有限公 司惠赠。RNA 提取所用 TRIZOL 液及 Superscript 逆转录试 剂盒购自 Invitrogen 公司。PCR 扩增引物由上海生工生物 工程公司合成。Celltac 全自动血液分析仪为 NihonKohden 产品，8800 型凝胶成像分析系统为 AlphaInnotech 产品。 ACD 模型的建立 小鼠经乙醚吸入麻醉后，在背部双肩胛骨之间脂肪垫 内注射松节油（ml/20g 体重） ，每周 1 次，共注射 4 次，末 次注射 4 周后（第 8 周）处死小鼠进行检测。对照组脂肪 垫内注射等量生理盐水。 rhEPO 对 hepcidin 的影响 腹腔注射 rhEPO50U（用无菌生理盐水稀释成 ml） ，每 天 1 次，共 3 天，末次注射 24 小时后处死小鼠进行检测。 小鼠摘眼球取血于肝素抗凝管中送检。用颈椎脱臼法处死 小鼠，打开腹腔，充分暴露肝组织，取肝脏左叶，去除大 血管与表面的筋膜组织，将其剪成 1cm1cm 大小的组织块， 用 DEPC 水清洗后置于冻存管中，投入液氮中冷却后放入- 80冰箱保存。用电子天平称量肝组织 50-100mg，置于装 有 1mlTRIZOL 液的 mlEppendorf 管中，用剪刀将肝组织充 分剪碎，剧烈振荡后静置 5 分钟。根据 TRIZOL 产品说明提 取总 RNA，使用 Superscript 逆转录试剂盒合成 cDNA，然 后进行小鼠 hepcidin-1 与 -actin 的 PCR 扩增，其引物 序列分别为：hepcidin（hepc1）：（上游）5- CCTATCTCCATCAACAGATG-3与（下游）5- AACAGATACCACACTGGGAA-3 ；内参照 -actin：（上游） 5-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3及（下游）5- TTTGATGTCACGCACGATTT-3 。扩增条件为 9420 秒50 20 秒7220 秒，共 25 个循环。PCR 扩增产物电泳并拍照。 采用 Innotech 附带凝胶图像分析系统进行分析。对照组腹 腔注射