tcdd对斑马鱼胚胎发育毒性的研究进展(1)

TCDDTCDD 对斑马鱼胚胎发育毒性的研究进展对斑马鱼胚胎发育毒性的研究进展 (1)(1) 作者：李万芳，靳洪涛，王爱平 摘要】二恶英具有致癌、致畸作用以及心血管神经内 分泌毒性，近几年研究发现二恶英的胎盘毒性是其导致宫 内死亡的重要原因。TCDD 是二恶英类化合物中毒性最强的 一种。TCDD 对斑马鱼胚胎发育毒性有了较全面和深入的认 识，对阐明 TCDD 对人类胚胎发育毒性有重要意义。 【关键词】2，3，7，8-四氯二苯并对二恶英（TCDD） ； 斑马鱼；胚胎发育毒性 自我国加入关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约 ， 简称POPs 公约 ，人们对环境持久性污染物（POPs）的认 识不断加强，有关二恶英（Dioxin）的研究也受到重视。 除皮肤毒性、生殖毒性、免疫毒性、致癌性之外，二恶英 的胎盘毒性尤为引人注目1 。其中，2,3,7,8四氯二苯 并对二恶英（2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，简 称 TCDD）毒性最强，同时也是研究最彻底的，因此常常用 TCDD 这个称呼来代替二恶英类化合物。TCDD 对猴、兔、豚 鼠、大鼠、小鼠、鸡的毒性研究较多，鱼类也是 TCDD 的敏 感生物之一，特别是在胚胎期2 。 斑马鱼（Daniorerio）是属于辐鳍亚纲 （Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属 （Danio）的一种硬骨鱼。1981 年，Streisinger 等报道了 斑马鱼的体外受精及单倍体诱导技术，建立了纯合品系， 并介绍了斑马鱼的第一个自然突变体-golden，至今已证明 斑马鱼是适合用于饱和诱变的唯一的脊椎动物。目前斑马 鱼、人、小鼠是生命科学研究中三种主要的模式脊椎动物。 1 斑马鱼作为胚胎发育毒性研究模式生物的优势 首先，斑马鱼是脊椎动物，心血管、血液、消化道、 肝脏、肾脏以及视觉系统与人类相应系统有许多共同特点。 斑马鱼的基因组中含有约 30000 个基因，这个数目与人差 不多，而且它的许多基因与人体存在相应关系。 其次，斑马鱼还具以下独特优势：成年鱼个体小，易 于饲养；常年产卵，成熟的雌鱼每隔 1 周可产几百枚卵； 卵在体外受精、发育，对母体无任何影响；从受精卵发育 到完整的胚胎形成只需 24h。又由于胚胎完全透明，可视性 好，即使在发育的高级阶段，仍然可以观察到全部的细胞， 荧光染色或使用其他标记物可使细胞系观察得更清楚3 。 研究者不仅能跟踪观察每个细胞的发育命运，也可观察到 原肠期的细胞运动、脑区形成和心跳等胚胎发育情况4 ， 同时发育异常的突变体也很容易被鉴别出来5 。现对于 斑马鱼的研究已经成功地发展了突变技术，建立了斑马鱼 遗传图谱，分析了有价值的突变体，成功地发展了转基因 斑马鱼技术，这些都成为毒理学研究的优良资源。 另外，斑马鱼的胎心类似于人胚胎的心脏，分为心房 和心室，房室之间有瓣膜。斑马鱼特别适合于心血管系统 的研究，因为在活的鱼卵中，心脏明显的形态和功能缺陷 能用肉眼直接观察到，较细微的差别可通过分子标记物来 识别。而且斑马鱼仔鱼早期生存不依赖于血液循环6 ， 这为观察心血管系统异常发育的发展过程提供了一个极好 的模型。 2TCDD 对斑马鱼的胚胎毒性 致死性董武、魏强等报道 24hpf（受精后 24h）染毒至 180hpf，摄食对照群， g/L，g/L，g/L，1g/L，10g/L 染毒群的死亡率 分别是 0，0，5%，%，%，100%。10g/L 染毒群在 144hpf 已全部死亡7 。这种试验条件下 180hpf 的 LC50 约 为g/L。Henry 等测定 240hpf 的 LC50 为 TCDD/gegg8 。 使用 6ng/mlTCDD（4hpf）染毒，144hpf 开始出现死亡， 240hpf 全部死亡，虽然推迟至 96hpf 染毒能避免心血管缺 陷的出现，但并不能避免致死现象9 。可见，TCDD 引起 的致死性不依赖于心血管毒性。 下颌发育短小斑马鱼下颌发育短小已成为 TCDD 引起的 典型毒性之一1014 。24hpf 开始对斑马鱼胚胎持续静 态染毒至观察结束，1ppb 染毒群在 60hpf 引发下颌生长的 显著（P 尽管躯干血液循环显著降低，但直到下颌生长 晚期下颌血液循环才受到影响。60hpf 鳃下动脉是下颌原始 基的主要灌注血管。72hpfTCDD（,1ppb）显著增加鳃下动 脉分支的红细胞灌注率，至 96hfp 两高剂量组（,1ppb）才 出现对红细胞灌注率的显著抑制。最初红细胞灌注率显著 增加可能是下颌生长或其他循环中断的代偿反应。这些结 果表明局部循环障碍和下颌发育迟缓是分离的，至少在 6072hpf 期间是分离的。下颌短小可能是 TCDD 对下颌原 始基的直接作用，而严重的循环障碍在后期可能会进一步 加重损伤。 神经系统 Adrian 等发现 TCDD（2hpf）染毒可减小胚胎 脑容量，且相同身长的鱼，脑容量的减小程度随 TCDD 浓度 增加而加剧。各组内胚胎脑容量与身体大小线性相关 （r2values：丙酮对照组,100ppt 染毒组,120ppt 染毒 组） 。测定神经元密度后与脑容量相乘，进而分析神经元 总量的变化。100，120ppt 染毒组 168hpf 表现出神经元显 著的缺失。眼部杆锥层和脑部（松果体，midbrain- hindbrainboundary，端脑，间脑）的解剖学检查表明 TCDD 染毒对神经系统的结构发育没有影响16 。 染毒的仔鱼脑神经元容量变小，使学习和行为能力下 降，易发生早期残疾，因此导致它们易被捕食。再加上 TCDD 具生物蓄积性，在受到 TCDD 污染的环境中，神经学缺 陷在食物链的越高级的动物中会越明显。 循环系统 总主静脉（CommonCardinalVein）CCV 是左右两侧连接 前、后主静脉和心脏的一对血管，在发育的第 1 周将所有 静脉血液送回心脏。它也是 60hpf 前通过卵黄囊的唯一血 管。CCV 在发育的过程中出现广泛的重塑（remodel）过程 17 。 使用血管内皮细胞特异表达 GFP 的 Fli1-eGFP 转基因 斑马鱼用来观察 CCV 的发育情况，斑马鱼胚胎受精后 TCDD（10ng/ml）染毒 1h 对总主静脉的发育产生显著影响 18 。对照组，约 24hpfCCV 的血管内皮细胞出现， 4874hpf 发生 CCV 由片状血管内皮细胞到管状的重塑过程， 74hpf 总主静脉建立和心脏静脉窦的联系，几乎同时由于心 脏向背侧的移行，总主静脉失去和心包脏层的联系，开始 退化。染毒组 44hpf 首次检测到对 CCV 生长的显著抑制， 62hpfCCV 区域减小到对照组的 63%，随后由于对照组在重 塑过程中 CCV 区域亦显著减小，对照组和染毒组的区别不 再明显。80hp