sirna真核表达载体阻断hela细胞stathmin基因表达研究(1)

SiRNASiRNA 真核表达载体阻断真核表达载体阻断 HeLaHeLa 细胞细胞 stathminstathmin 基因表达研究基因表达研究(1)(1) 作者：王燕，吴冰，苏海川，刘丽，林芳，张惠中 【关键词】真核表达载体 BlockingeffectofvectorbasedsiRNAonstathmingeneexpre ssioninhumanHeLacells 【Abstract】AIM:ToexploretheblockingeffectofsiRNAon theexpressionofstathmingeneinHeLacelllineusingsiRNA eukaryoticexpressionvector.METHODS:TwostathminsiRNA cDNAsweresynthesizedaccordingtothestathmingeneseque nceandclonedintothevectorandnamedpSilencerS1andpSil encerS2respectively,whichwerefurtheridentifiedbyres trictionendonucleasedigestionanalysisandDNAsequenci ng.HeLacellswerethentransfectedwithpSilencerS1andpS ilencerS2.AfterG418selection,thecellswereselectedan dtheinterferingeffectwasdetectedbyRTPCR.RESULTS:Res trictionendonucleasedigestionanalysisandDNAsequenci ngresultsshowedthatthe2targetsegmentswereclonedinto neovectorrespectively.TheresultsofRTPCRindicatedtha tbothsiRNAvectorscouldsuccessfullyknockdownstathmin geneexpression.CONCLUSION:ThevectorbasedsiRNAonstat hmingenecaneffectivelyknockdownstathmingeneexpressi on,whichhasthepotentialofbeingappliedingenetherapya gainstmalignanttumors. 【Keywords】stathmin;RNA,smallinterfering;eukaryoti cexpressionvector;HeLacells 【摘要】目的：构建人 stathmin 基因的 siRNA 真核表 达载体，探讨其对 HeLa 细胞中 stathmin 基因表达的干涉 作用.方法：将合成的 siRNA 寡核苷酸链退火形成双链，连 接入经 BamH和 Hind双酶切后的 neo 真核表达载体，酶 切及测序鉴定.脂质体法转染重组质粒入 HeLa 细胞，G418 筛选后 RTPCR 检测其对 stathmin 基因 mRNA 的干涉效果.结 果：经酶切及测序鉴定，成功构建 siRNA 真核表达载体.经 脂质体转染 HeLa 细胞后，RTPCR 显示所构建的干涉 stathmin 基因的真核表达载体成功地抑制了目的基因的表 达，HeLa 细胞中 stathmin 基因的 mRNA 表达水平明显降低. 结论：成功构建了人 stathmin 基因的 RNA 干涉真核表达载 体 pSilencerS1 和 pSilencerS2，并在 HeLa 细胞中有效地 发挥了对 stathmin 基因表达的干涉作用. 【关键词】stathmin；RNA，小分子干扰；真核表达载 体；HeLa 细胞 0 引言 Stathmin 为一种高度保守的细胞内蛋白，在多种恶性 肿瘤细胞中高表达，研究表明1，2通过应用反义核酸、 单克隆抗体、核酶、stathmin 蛋白抑制剂及丝氨酸位点突 变体等方法封闭该基因表达均证实，抑制其表达可使细胞 受阻于 G2/M 期，同时还可以使恶性肿瘤表型发生逆转.因 此，stathmin 是一个极具吸引力的恶性肿瘤生物治疗新靶 点.RNA 干涉是最新的基因敲除技术，具有高效性和特异性， 能够降解与之序列相对应的细胞内 mRNA,使基因转录后沉默.许 多学者3-5认为该技术的出现是基因功能研究及基因治 疗研究手段的又一次革命性突破.本试验通过构建针对 stathmin 基因的 siRNA 真核表达载体，以阻断肿瘤细胞内 stathmin 基因的表达，探讨肿瘤基因治疗新的模式. 1 材料和方法 材料 质粒提取试剂盒（Wizard plus Minipreps DNA Purification System）,pGEMTeasy 载体连接试剂盒，逆 转录试剂盒 ReverseTranscriptionSystem 购自 Promega 公 司.neo 载体及阴性对照 neonegtivecontrol 为 Ambion 公司 产品.限制性内切酶 BamH和 Hind为 Takara 公司产品， LipofectamineXX 购自 Invitrogen 公司.TaqDNA 聚合酶， DGLXXDNAMarker 及琼脂糖凝胶购自鼎国生物技术有限公司. HeLa 细胞及宿主菌株大肠杆菌 JM109 为本实验室保存. 方法 针对 stathmin 基因的 siRNAcDNA 设计和制备根据 GenBank 中 stathmin 基因的序列及 siRNA 设计原则，在编 码区内选择两段 19nt 作为不同的干涉区域，分别进行 BLAST 分析.根据 RNA 干涉载体 neo 的要求分别于上、下游 引入 BamH和 Hind酶切位点.每段各设计一对 55 个碱基 的序列，由博亚生物技术有限公司合成.两对 stathmin 基 因的 siRNAcDNA 序列如下： 5GGATCCGAAACGAGAGCACGAGAAATTCAAGAGATTTCTCGT GCTCTCGTTTCAGAAGCTT3，互补链为： 5AAGCTTCTGAAACGAGAGCACGAGAAATCTCTTGAATTTCTCGT GCTCTCGTTTCGGATCC3；另一对为： 5GGATCCCGTTTGCGAGAGAAGGATATTCAAGAGATATCCTTCTCT CGCAAACGAGAAGCTT3,互补链： 5AAGCTTCTCGTTTGCGAGAGAAGGATATCTCTTGAATATCCTTCT CTCGCAAACGGGATCC3.斜体部分为 siRNAcDNA 序列，中间 为 Loop. 构建 siRNA 的 neo 真核表达载体将合成的互补链分别 退火，形成带有粘端的双链，用 T4 连接酶分别连接入线性 化的 neo 载体中 BamH和 Hind酶切位点之间.转化 Jm109 大肠杆菌，挑选阳性克隆，扩增并提取质粒，用 BamH和 Hind双酶切鉴定.酶切鉴定正确的克隆送上海基康公司测 序，分别命名为 pSilencerS1 和 pSilencerS2. 脂质体介导的 HeLa 细胞的转染在 6 孔板内按照105 细胞/孔接种细胞，第 2 日转染重组质粒及阴性对照质粒 neonegtivecontrol（空载体） ，操作步骤按 LipofectamineXX 说明书进行.转染后 48h 换为含 G418 的选 择培养基培养，1012d 后获得 3 种质粒转染后的 HeLa 细胞 稳定克隆. 法检测转染重组质粒 HeLa 细胞中 stathmin 基因表达 分别收集 3 种转染后的 HeLa 细胞和未转染的 HeLa 细胞各 106,TrizolRNA 分离试剂提取细胞总 RNA.取 5g 总 RNA，加入 1Loligo,按照逆转录试剂盒说明书操作，合成 cDNA 第 1 链.PCR 引物自行设计.上游引物为： 5TACCGAAGAAGACTATAGGT3；下游引物为 5ATCAGTCGAAGTCAGAGCA3.取 2L 逆转录产物为模板， PCR 反应参数为：94预变性 3min；94变性 30s，58退 火 30s，72延伸 30s，30 个循环；72延伸 10min.并以 actin 引物为内参照，上游引物为： 5TCTGACACCACA