医学课件生物中心主要项目

生物中心主要项目 吕成伟 南方医院生物治疗中心 应用项目 nCIK (Cytokine induced killer) nTIL (Tumor infiltrating lymphocytes) nDC/CTL (Dendritic cell / Cytotoxic T lymphcytes) n放免靶向治疗（131I -McAb ） n肿瘤标志物 CIK n1976年Morgan等发现小鼠脾细胞 培养上清能刺激胸腺细胞生长的T细胞生长 因子；1979年统一命名为IL-2。 n1980年发现IL-2 能诱导自身LAK 。 n1983年Taniguchi等从Jurkat白血 病细胞成功克隆人IL-2的cDNA，基因工程 IL-2问世，推动了基础和临床应用。 n肿瘤、免疫缺陷、感染等 IL-2 CIK nIL-2主要由T细胞或T细胞系产生： （1）CD4或CD8 T细胞： 丝裂原 CD4或CD8 同种异体Ag CD4 (PBMC、脾脏、淋巴结和扁桃腺T 细胞） （2）T细胞肿瘤细胞系或白血 病细胞系 （3）T淋巴细胞杂交瘤 IL-2 CIK nIL-2生物学作用： （1）CD4及CD8细胞都是IL-2作用 靶细胞 （2）促进杀伤细胞分化和效应 功能： 诱导CTL、NK、LAK等分化和效 应功能 诱导杀伤细胞产生IFN-、TNF- 等 增强CTL穿孔素基因表达 （3）直接或间接作用B细胞 （4）活化巨噬细胞： 促进M 通过ADCC杀伤肿瘤 CIK n1980年NIH癌症研究所Rosenberg等 首先发现LAK细胞(lymphokine activated killer cell): 1. 纤维肉瘤C57BL/6小鼠脾细胞 IL-2 纤维肉瘤细胞（自身正常 细胞） 2. PBL + IL-2 自体或同种异体瘤细胞(MHC 非限制性） 3. LAK存在于大颗粒淋巴细胞（ large granular lymphocytes,LGL)中，不同于T、B细 胞和单核细胞 LAK细胞 CIK n多种细胞因子均可增强LAK活性： GM-CSF、TNF、IL-1、3、 5、6 IFN-显著增强LAK活性 Anti-CD3 McAb联合IL-2不 仅能比单用IL-2更显著增加LAK数量也使 单个和总体LAK细胞活性显著增加。（100 400倍/620倍） CIK nLAK体外长期培养:(临床) 35天 23周 数量100 1000倍 联合PHA或ConA 数量比单用IL- 2高510倍。初始培养48小时内加入10ng/ml Anti-CD3扩增更明显，21天达1000倍。加入 IFN-单个LAK细胞抗瘤活性提高几十倍。 LAK CIK (Cytokine induced killer) CIK nCIK的杀瘤机制 n 直接杀瘤： 识别结合相 效靶复合体 杀伤相 细胞毒颗粒；穿 孔素；Ca+ 裂解相 间接杀瘤： IL-2、TNF-、IFN-、IL-1等的 细胞毒/抑制作用；相互诱生、协同增强NK、M杀伤肿 瘤细胞。 CIK n只有联合应用IL-2/LAK细胞才具有显 著的体内抗肿瘤作用。 n1984年11月，FDA批准NCI进行临床 试验。 n1985年Rosenberg等首次报道联合IL -2/LAK细胞治疗25例各种常规疗法治疗无效的 晚期肿瘤患者的临床疗效。 nIL-2/LAK细胞引起世人瞩目，并在基 础和临床得到推广和改进。 n肾细胞癌、黑色素瘤、结直肠癌、非何 杰金氏淋巴瘤等疗效显著。 应用 CIK CIK制备流程 TIL n1986年发现经IL-2诱导的TIL体内抗瘤 效果强于LAK 50100倍；并可减少IL-2用量及 副作用。 n肿瘤间质，T淋巴细胞，CD8为主，非活 化，拌用少量IL-2即可发挥明显抗瘤效果，副作 用轻。 n新TIL中T细胞对PHA呈低增殖反应，少 分泌IL-2、IFN-等。 nAnti-CD3 McAb联合IL-2不仅能比单用 IL-2更显著增加TIL数量也使单个和总体TIL细胞 活性显著增加。可减少IL-2用量。 简介 TIL nTIL体外抗瘤作用 1. 经IL-2激活后TIL才具有显著杀 伤活性（740天）。 2. TIL杀伤活性具有一定特异性。 3. IL-4、TNF、IFN-等可显著增 强TIL杀伤作用。 4. 肿瘤抗原可增强TIL杀伤活性。（ 照射肿瘤细胞） TIL nTIL的体内抗肿瘤作用 1. TIL/IL-2输注具有显著的体内 抗肿瘤转移效果。 2. TIL体内抗肿瘤转移作用有一 定特异性。 3. IFN-可增强TIL/IL-2体内 抗肿瘤转移作用。 4. 环磷酰胺增强TIL体内抗肿瘤 作用。 CIK/TIL nCIK/TIL制备流程 无菌条件下抽取外周血/胸腹水（以肝素抗凝） 密度梯度离心 1500- 2000rpm，15-20分钟 分离获取外周血单个核细胞（PBMNC) 600-800rpm，5分钟 纯化PBMNC(去除Ficoll、血小板及杂质） 计数，110e6个细胞/ml 置培养瓶37， 5%CO2，100湿 度 诱导活化(IL-2,Human-serum,Anti-CD3,r- IFN,PHA) 第57天 高效扩增（IL-2,Human-serum,Anti-CD3) 第10-14天 收集CIK/TIL，全身/局部回输 *CIK/TIL临床应用 nCIK每疗程不低于100亿细胞； 首次抽血前一周或抽血后即可输注IL-2 ；首次抽血后79天第一次回输CIK细 胞。每周抽血一次，回输细胞两次；5 6周一疗程，全程拌IL-2治疗。 nTIL细胞经胸腔或腹腔穿刺收集 胸腹水200ml以上，分离淋巴细胞培养 ，721天内分13次胸腹腔输注完毕 。同时配合IL-2 20-50wu局部应用，2-3/ 周至积液完全吸收(或疗程结束)。 CIK/TIL DC细胞 n1973年Steinman和Cohn等从小 鼠脾组织分离 n共同特征：树突状，膜MHC-、CD80、 CD86，活化初始T细胞，激活CD8CTL、CD4Th细胞； 非成熟DC摄取、加工、处理抗原，成熟DC递呈抗原能力 是B、M的1001000倍，体内唯一专职抗原提呈细胞 ；MHC限制性。 n来源：骨髓、外周血、脐带血。 DC/CTL 肿瘤的发生与DC的功能缺陷 通过对肿瘤浸润性的研究发现 ：肿瘤细胞能自发分泌免疫抑制性细胞因 子、-、-10等作用于 ，使其表面分子的表达发生变化，无 法提呈外来抗原或提呈抗原的能力低下， 导致了肿瘤的免疫逃逸。 DC治疗的理论依据 n将机体的提取出来，经体外各 种免疫调节剂的激活，再用各种形式抗原 修饰(肿瘤抗原肽、细胞性抗原、 或等)，然后回输体内，激活细 胞 ,产生强大的抗肿瘤免疫反应，从而解决 因功能缺陷造成的肿瘤免疫逃逸。 DC/CTL制备 DC/CTL/IL-2的实施 (1) 微量法：抽血200ml/次，2周 一次，共4次为一疗程，全程用IL-2 50- 200wu 30-40次，或/和加IFN- 100wu 20-30次。 (2) 机分法：分离5000ml外周血 收集单个核细胞。 放射免疫治疗的定义放射免疫治疗的定义 以以单克隆抗体单克隆抗体为载体，以为载体，以放射性核素放射性核素为弹为弹 头，通过抗体特异性结合抗原表达阳性的头，通过抗体特异性结合抗原表达阳性的肿瘤肿瘤 细胞细胞，将产生，将产生 或或 射线的放射性核素射线的放射性核素靶向靶向到肿到肿 瘤细胞，并与肿瘤细胞特异性结合，实现对肿瘤细胞，并与肿瘤细胞特异性结合，实现对肿 瘤的近距离瘤的近距离内照射治疗内照射治疗。 单克隆抗体靶向治疗两种作用方式：单克隆抗体靶向治疗两种作用方式： 1.1.直接作用直接作用：通过抗体依赖性细胞介导细胞毒（通过抗体依赖性细胞介导细胞毒（ ADCCADCC）、补体依赖细胞毒（）、补体依赖细胞毒（CDCCDC）的细胞溶解效）的细胞溶解效 应杀伤肿瘤细胞。应杀伤肿瘤细胞。 2.2.间接作用间接作用：单抗作为靶向载体，偶联细胞毒药单抗作为靶向载体，偶联细胞毒药 物（放射性核素、化疗药物、毒素等）。靶向肿瘤物（放射性核素、化疗药物、毒素等）。靶向肿瘤 后利用细胞毒杀伤肿瘤细胞。后利用细胞毒杀伤肿瘤细胞。 放射免疫治疗是利用放射性放射免疫治疗是利用放射性 核素的辐射对肿瘤细胞进行杀伤核素的辐射对肿瘤细胞进行杀伤 作用。它必须是发射能量较大的作用。它必须是发射能量较大的 射线、射线、 粒子，最好是不发射粒子，最好是不发射 射线对病房的防护较方便。符合射线对病房的防护较方便。符合 上述条件的放射性核素不多。上述条件的放射性核素不多。 90Y90Y、186Re186Re、188Re188Re辐射能量辐射能量 大是放射免疫治疗的首选放射性核素，大是放射免疫治疗的首选放射性核素， 但国内来源较困难，标记技术也较复杂但国内来源较困难，标记技术也较复杂 。 131I131I为为 能量较小，也存在能量较小，也存在 辐射给辐辐射给辐 射防护带来不便，但其供应十分方便，射防护带来不便，但其供应十分方便， 因此，是国内放手免疫治疗最常用的核因此，是国内放手免疫治疗最常用的核 素素 当前低度当前低度NHLNHL治疗最有希望的治疗药物治疗最有希望的治疗药物 之一是能识别肿瘤相关抗原的单克隆抗之一是能识别肿瘤相关抗原的单克隆抗 体，体，如今，最有希望的免疫连接物如今，最有希望的免疫连接物 是放射性标记的抗体。是放射性标记的抗体。 20032003年年Press OWPress OW在在Seminars in Oncology:Seminars in Oncology: IODO-GENIODO-GEN碘化标记碘化标记 IODO-GENIODO-GEN是固相氧化剂，其碘化标记是固相氧化剂，其碘化标记 法于法于19781978年由年由FrakerFraker首先报道放射性碘首先报道放射性碘 溶液和蛋白质同时放入已用溶液和蛋白质同时放入已用IODO-GENIODO-GEN 包被的容器中，包被的容器中，I I被氧化并立即取代蛋被氧化并立即取代蛋 白质上酪氨酸残基中的白质上酪氨酸残基中的H H而成为放射性碘而成为放射性碘 化标记蛋白。经过数分钟后将标记物从容化标记蛋白。经过数分钟后将标记物从容 器中吸出即终止反应。经凝胶柱过滤后即器中吸出即终止反应。经凝胶柱过滤后即 可得到碘化标记物纯品。可得到碘化标记物纯品。 放射免疫治疗淋巴瘤的优势 n恶性淋巴瘤具有良好的放射敏感性 n治疗效果不受机体免疫功能影响 n射线 穿透力强，可到达肿瘤深部 n疗效可靠，毒副作用少 病例选择条件 n所有患者均有预后不良因素：如晚期、 高危、初治未达缓解、复发及全身多处淋巴结肿 大； n无重要脏器功能不全； nKarnofsky评分60分； n年龄70岁； n外周血常规白细胞（WBC） 3.0109/L，血小板（PLT）80109/L，血 红蛋白（HGB）90g/L； n病理免疫组化提示CD20(+)。 治疗模式 治疗模式 CD20单抗 131I 非清髓剂量 100-200mg 50- 100mci 清髓剂量 200-400mg 150-300mci 131I-抗CD20抗体应用方案 n标记方法：固相氧化剂标记法（IODOGEN） 。 n甲状腺保护：用药前一周至用药后一周连续口 服1%碘化钾溶液1020ml/次，每日三次。 n标记率及用法：每次剂量抗CD20抗体 100mg 标131I 50100