人参三七提取物促血管生成的信号转导机制研究田伟

人参三七提取物促血管生成的 信号转导机制研究 n田伟 雷燕 朱凌群 陈可冀 n中国中医科学院西苑医院 n北京中医药大学东直门医院 1 1 研究背景 n益气活血中药治疗冠心病取得较好疗效，促血管生 成可能是的重要机制之一 n前期研究发现益气活血中药有促进血管生成、改善 心肌缺血，增强血管内皮细胞增殖与迁移的作用， 但其信号转导机制和作用靶标？ 2 2 研究背景 n细胞信号通路是细胞应答内外环境信息，经信号网络整 合作用调节基因表达及细胞增殖、分化、发育的途径。 细胞的增殖、分化主要与有丝分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)途径有关。Ras是调节细胞生长的重要转导蛋白 ，通过Ras-Raf-MAPK最后产生级联反应 n观察人参三七提取物对血管内皮细胞血管生成信号蛋白 的作用，以阐明益气活血药促血管生成信号转导途径 3 3 血管生成的过程 n外因 活化邻近的血管内皮细胞 n血管内皮细胞分泌蛋白酶降解基底膜及细胞外基 质 n血管内皮细胞增生 n血管内皮细胞改组形成小管，随后吻合成网状并 注入血流 4 4 研究思路 n 中药促进内皮细胞增殖 n 信号转导机制 n 中药作用靶点 血管生成信号通路 VEGF VEGFR-2 Ras MAPK 信号阻断 VEGFR-2 Ras 5 5 VEGF VEGFR Ras 血管生成信号通路：VEGFVEGFR-2RasMAPK 6 6 实验1 人参和三七不同配比、 浓度 、 时间对HUVEC增殖的影响 配比：1：1；1：2；2：1 浓度：0.25mg/ml、 0.5mg/ml、1mg/ml、 2mg/ml、4mg/ml 时间：24h，48h 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 12345 时间（天） MTT A B C D E F HUVEC 不同浓度、不同时间点 生长曲线图 7 7 24h内皮细胞增殖直方图 n人参三七提取物 n配比：2：1 n浓度 ：4mg/ml n时间：培养24h nHUVEC增殖作用最强 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 人参：三七(1:1)人参：三七(1:2)人参：三七(2:1) 空白对照组 0.25mg/mL 0.5mg/mL 1mg/mL 2mg/mL 4mg/mL MTT 8 8 实验2 人参三七提取物促VEC增殖 和分泌VEGF n实验分为5组 nMTT 检测各组细胞增殖 nELISA 检测上清VEGF含量 n人参、三七能够促进 HUVEC增殖和分泌VEGF 9 9 实验3 人参三七提取物促VEC上VEGFR-2表达 n免疫组化SP法 阳性细胞光密度阳性细胞光密度阳性细胞数 人参、三七能促进VEGFR-2的表达，其作用和bFGF相当 1010 实验4 人参三七提取物对血管生成 信号蛋白及其mRNA的影响 n检测血管生成信号通路上VEGFR-2、Ras、 MAPK 蛋 白及其mRNA表达 n探讨益气活血中药干预后，对血管生成信号蛋白VEGFR -2、Ras、MAPK表达的影响 n方法：western blotting ;RT-PCR 1111 信号蛋白VEGFR-2 、Ras、 MAPK蛋白 及其mRNA的表达 ABCDE ABCDE 21kD -actin VEGFR-2 -actin Ras A 空白组；B bFGF组；C 中药大剂量组；D 中药中剂量组；E 中药小剂量组 各组 VEGFR-2 蛋白的表达各组 Ras 蛋白表达比较 43 kD 43 kD 215 kD -actin MAPK 43 kD 46 kD 各组MAPK蛋白表达条带 ABCDE 1212 表1 各组蛋白免疫印迹杂交信号强度 灰度平均值比较 (n=3) , 组别 VEGFR-2/-actinRas/-actinMAPK/-actin 空白对对照1.580.1020.280.0010.38.0110 bFGF组组2.110.2110.420.0170.58.0206 中药药大剂剂量2.070.1890.530.2370.45.0299 中药药中剂剂量1.480.1730.340.0290.38.0215 中药药小剂剂量1.390.2610.490.0280.48.0142 注：与空白组组比较较， P0.05； P0.011313 血管生成信号蛋白MARK及其-mRNA的表达 1414 结果和结论 u 与空白组相比，中药大剂量 组VEGFR-2、Ras 蛋白表达 明显增强，小剂量组MAPK 、Ras蛋白表达明显上调。 bFGF组VEGFR-2、Ras、 MAPK的表达显著增强，差 异均有统计学意义（ P0.05P0.01） u 人参、三七可促进血管生成信 号蛋白 VEGFR-2 Ras MAPK的表达 u 可能是益气活血药促内皮增殖 ，产生血管生成效应的基础 u 以上三个信号蛋白的mRNA表 达未见增加 1515 实验5 SU5416阻断对VEGFR-2下游 信号蛋白的影响及中药干预 u目的：观察下游信号蛋白 Ras/MAPK表达，明确中药 作用靶点 u方法：加入半数抑制量的SU5416，对信号通路关键蛋白 VEGFR-2进行 IC50 阻断，中药干预 uSU5416：VEGFR-2 酪氨酸激酶的抑制剂，能阻断来自 细胞外血管生长刺激信号和已激活信号的转化通路 1616 SU5416阻断后，Ras表达 n n A：空白组 n B：SU5416组 n C：SU5416+中药大剂量组 n D：SU5416+中药中剂量组 n E：SU5416+中药小剂量组 1717 SU5416阻断后，MAPK表达 n A：空白组； n B：SU5416组； n C：SU5416+中药大剂量组； n D：SU5416+中药中剂量组； n E：SU5416+中药小剂量组 1818 结论 p人参、三七组方可以 显著促进 Ras蛋白的表达 促进 MAPK蛋白的表达 p可以确定中药直接作用于Ras p暂不能肯定中药是否作用于Ras下游信号蛋白MAPK 1919 实验6 FPP对下游信号蛋白MARK 的影响及中药干预 n目的：观察下游信号蛋白MAPK表达，明确中药靶点 n方法：加入半数抑制量的FPP，对Ras 进行IC50 阻断， 中药干预 nFPP：是法尼基转移酶（FTase）的竞争性抑制剂，FPP 和Ras蛋白均为FTase的底物，FPP可以竞争性抑制法尼 基转移酶，从而抑制Ras信号蛋白的传导 2020 FPP阻断后，MAPK 表达 n n A：空白组； n B：FPP组； n C：FPP+中药大剂量组； n D：FPP+中药中剂量组； n E：FPP+中药小剂量组 n图8-1 各组MAPK蛋白表达条带 2121 结论 n 人参、三七组方可以 促进 MAPK 蛋白的表达 n 中药直接作用于MAPK这一靶点 2222 实验7 三维细胞培养HUVEC形成 血管样结构 目的：比较二维与三维培养HUVEC成血管样结 构，在形态学上的差别 方法：利用Transwell 构建三维培养体系 2323 二维细胞培养 （x10） 2424 二维细胞培养 （x10） 2525 细胞培养第3天 （x10） 2626 细胞培养第4天 （x10） 2727 细胞培养第5天（x10） 2828 LSCM逐层扫描 2929 LSCM合成立体图形 3030 L