str－pcr分析嵌合体在同种异基因造血干细胞移植中的应用(1)

STRSTRPCRPCR 分析嵌合体在同种异基因造血分析嵌合体在同种异基因造血 干细胞移植中的应用干细胞移植中的应用(1)(1) 作者：孙敬芬 韩晓苹 赵丹丹 汪菲菲 靳海杰 高春记 达万明 于力 【摘要】 利用荧光标记的多重 PCR 扩增短串联重 复序列结合毛细管电泳检测供者细胞嵌合率,以探讨该方法 的连续检测对异基因造血干细胞移植后转归的预警作用， 采集 27 例清髓性外周血干细胞移植患者移植前、移植后不 同时段的外周血或骨髓，DNA 样本用 ProfilerPlus 和 CofilerPlus 商品化试剂盒扩增后,用 ABI310 遗传分析仪进 行毛细管电泳,确定基因位点及峰面积,根据基因型的差异 选择嵌合率计算公式。结果表明：两种试剂盒测得的 DC 嵌 合率一致;在 27 对中能区别出供受差别的 STR 位点， ProfilerPlus 为个,CofilerPlus 为个。26 例患者均在移植 后 28 天出现供者细胞，1 例患者未出现供者细胞。14 例患 者 DC100%,均获得持久植入,至今仍无白血病生存；另有 9 例患者出现不稳定混合嵌合状态,其中 5 例为血液学复发。 27 例病人中有 6 例死亡。上述 5 例复发患者均在出现临床 症状前发生 DC 量下降;供者细胞完全嵌合组移植物抗宿主 病的发生率高于 MC 组。结论：动态检测 DC 可用于移植动 力学研究,对移植物早期植入或被排斥、疾病复发以及 GVHD 的发生均有预警作用,对早期实施临床干预治疗有重要的指 导意义。 【关键词】同种异基因造血干细胞移植；STRPCR;毛 细管电泳;嵌合体 ApplicationofChimerismAnalysistoAllogeneicHematopoi eticStemCellTransplantationbySTRPCR AbstractTheaimofthisstudywastoanalyzechimerism,eval uatethestatusofengraftmentandpredicttheoutcomeofall ogeneichematopoieticstemcelltransplantationbymultip leshorttandemrepeatamplificationusingfluorescencela belingpolymerasechainreactioncombinedwithcapillarye lectrophoresis.Peripheralbloodandbonemarrowin27pati entswhoreceivedmyeloablativeallogeneticcelltranspla ntationwerecollectedbeforeandaftertransplantationin differenttimes.10and7differentSTRmarkerswerecoamp lifiedinasinglereactionbyusingacommercialAmpF/STRPr ofilerPlus/CofilerplusPCRamplificationkits.Separati onofthePCRproductsandfluorescencedetectionwereperfo rmedbyABIprism310GeneticAnalyzerwithcapillaryelectr ophoresis.TheGenescanandGenotypesoftwarewereusedfor sizecallingandquantificationofpeakareas.Theformulat ocalculatedonorchimerismvalueswasbasedonthediffer entallelicdistributiontypebetweendonorandrecipient. Theresultsshowedthatdonorchimerismwassimilarbythetw omethods.ThemediannumberofinformativealleleswasbyPr ofilerPlusandbyCofilerPlus.Thedonorallelesappearedi n26patientsonday28posttransplantation.Onepatientwas notobservedtoappeardonoralleles.14patientswith100%d onorchimerismhadstableengraftmentandtheystillsurviv einfreeleukemia.9patientshadunstablemixedchimerism, and5ofthemrelapsedafteralloHSCT,6patientsdied.Dec reaseofdonorchimerismappearedpriortograftrejectiona nddiseaserelapse.TheincidenceofGVHDwashigheringroup offulldonorchimerism.Itisconcludedthatdynamicmonito ringdonorchimerismbySTRPCRincombinationwithallaut ocapillaryelectrophoresisisavaluabletoolforpredic tinggraftrejection,diseaserelapseandoccurrenceofGVH D,andprovidesabasisforearlyclinicalinterventioninth epatientsreceivedalloHSCT. Keywordsallogeneichematopoieticstemcelltransplantat ion;STRPCR;capillaryelectrophoresis;chimerism JExpHematolXX;15:337-341 同种异基因造血干细胞移植是治疗恶性血液病和免疫 缺陷性疾病的有效手段之一,移植成功与否与供者细胞在受 者体内的植入情况,即嵌合体的形成有关。供者细胞嵌合率 的下降与移植物排斥及本病复发密切相关1,因此移植 后动态检测嵌合状态对判断移植效果、实施临床早期干预 治疗尤为重要2 。目前，嵌合体的监测已成为同种异基 因造血干细胞移植术后患者的常规检测项目，检测方法已 由传统的细胞学和遗传学方法发展到分子生物学方法，其 中荧光标记的多重 PCR 扩增 STR 位点结合全自动毛细管电 泳方法敏感性高,重复性好,简单高效,已成为目前国际骨髓 移植登记处推荐的检测供受嵌合状态的金标准。我们用上 述方法对 27 例 alloSCT 患者嵌合状态进行了连续动态检 测。 一般资料 27 例病人为 XX 年 10 月-XX 年 7 月在中国人民解放军 总医院血液科及其附属 304 医院血液科接受 alloHSCT 的 患者,其中急性髓系白血病 8 例,急性淋巴细胞白血病 2 例, 慢性粒细胞白血病 11 例,急性非淋巴细胞白血病 2 例，再 生障碍性贫血 2 例，类小细胞肺癌 1 例，骨髓增生异常综 合征 1 例。27 例中接受同胞供者外周血干细胞移植者 22 例,接 受无亲缘关系供者外周血干细胞移植者 5 例。男 22 例,女 5 例,中位年龄岁。供受者性别相合 19 例,性别不合 8 例， 20 例同胞供者 HLA 均相合;2 例为父母给子女 HLA 单倍相合 供者；非亲缘供者 HLA 相合 4 例,HLA 不相合 1 例。 样本采集 术前采集供者和受者外周血或骨髓,术后 28 天采集受 者骨髓,术后 3 个月内每月 1 次采集骨髓,此后每 3 个月 1 次采集受者骨髓，部分复发者每 2 周采集 1 次骨髓或外周 血，肝素抗凝,4保存。 试剂和仪器 DNA 抽提选用美国 Promega 公司 DNAPurificationkit 试剂盒,PCR 扩增试剂盒为美国应用生物系统公司 AmpF/PSTRProfilerplus 和 CofilerPlus 商品化试剂盒,选 择 D3S1358、vWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818 、D13S317、D7S8209 个基因位点和 1 个性别位点及 D3S1358、D16S539、TH01、TPOX、CSF1PO、D7S820 和 1 个 性别位点所对应的荧光标记的特异性引物同时进行复合扩 增,基因位