rna干扰技术抑制ec109细胞survivin基因表达及其促凋亡研究(1)

RNARNA 干扰技术抑制干扰技术抑制 EC109EC109 细胞细胞 survivinsurvivin 基因表达及其促凋亡研究基因表达及其促凋亡研究(1)(1) 这篇RNA 干扰技术抑制 EC109 细胞 survivin 基因表达 及其促凋亡研究论文是程序自动抓取于互联网上，查看 更多请点击：论文频道：lwxz/ 【摘要】 目的：应用 RNA 干扰技术（RNAi）研究针对 survivin 基因的 siRNA， 抑制 survivin 基因的表达并诱导食管癌细胞系 EC109 细 胞的凋亡.方法：构建针对 survivin 的 siRNA 表达质粒， 转染至 EC109 细胞，荧光显微镜判断转染效率，蛋白质 印迹和半定量 RTPCR 检测 survivin 蛋白表达及基因转录 水平的变化，并在不同时间点收集转染细胞，利用流式细 胞术及基因组 DNA 凋亡检测试剂盒，观察 siRNA 抑制 survivin 基因表达后诱导细胞凋亡的情况.结果：荧光显微 镜结果表明，重组质粒转染效率达.半定量 RTPCR 检测 到 pSIREN/S 质粒在 EC109 细胞内对 survivin 基因的转 录抑制率为%；蛋白质印迹结果表明，转染重组质粒 pSIREN/S 的 EC109 细胞 survivin 蛋白表达量仅为正常组 的%，而对照质粒 pSIREN/CN 对 survivin 基因的蛋白表达 及转录均没有抑制作用.经 pSIREN/S 转染的 EC109 细胞 基因组 DNA 出现明显的 DNAladder，流式细胞仪分析结果也 显示凋亡细胞为%.结论：survivin 特异性 siRNA 可明显抑 制 survivin 基因的转录和表达，并能有效地诱导 EC109 细胞的凋亡，为下一步在体内利用 pSIREN/S 重组质粒沉寂 survivin 基因，促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础. 【关键词】 RNA 干扰技术食管肿瘤 survivin 基因 EC109 细胞 0 引言 潮汕地区是中国六大食管癌高发区之一，据统计，广 东省南澳县恶性肿瘤死因构成的排位顺序为食管癌最高， 占恶性肿瘤死亡总数的半数以上1.因此对于食管癌特 别是中晚期患者，寻找有效的治疗手段至关重要.survivin 是 IAP（inhibiteapoptosisprotein）家族成员之一，具有 抑制凋亡的作用；同时也是细胞周期调节蛋白，通过干扰 细胞的有丝分裂以调节细胞的凋亡2.已有文献3-5 报道，食管癌患者的肿瘤组织中 survivin 的表达明显高于 正常组织，我们利用 siRNA 技术，以食管癌 EC109 细胞 株为模型，利用 survivin 特异性 siRNA，对 survivin 基因 的转录、表达及其诱导 EC109 细胞凋亡进行了研究. 1 材料和方法 材料 人食管鳞癌细胞株 EC109 为汕大医学院沈忠英教授 馈赠.大肠杆菌 DH5 及 RNAi 载体质粒 RNAiReadypSIRENDNRDsRedExpression 购自 Invitrogen 公司.RPMI1640、小牛血清、胰蛋白酶等购自 Sigma 公司.脂质体 LipofectamineXX 购自 Invitrogen 公司.兔 抗人 survivin 单抗购自 SantaCruze，CY3 标记的羊抗兔 IgGFc 抗体购自武汉博士德公司.限制性核酸内切酶 EcoRI，BamHI 等购自 NEB 公司.T4DNA 连接酶、DLXX 标准 Marker 由 TaKaRa 公司提供.质粒提取试剂盒购自上海博光 生物技术有限公司.RNaeasyKit 购自 Qiagen 公司. 方法 抑 survivinsiRNA 序列及载体构建 根据 survivin 的编码序列及以往的研究资料，结合 siRNA 序列设计原则并利用 Blast 进行查询，确定其为特异 性 survivinRNA 干扰的靶序列,其正义链: 5gatccaaagcattcgggttgcttcaagacggcaaccggacgaatgctt tttttttgaattca3,反义链: 3agcttgaattcaaaaaaaaagcattcgtccggttgccgtcttcaagca accggacgaatgctttg5.为排除 siRNA 本身的影响，我们设 计了无关的 siRNA 序列，CN 序列，即正义链为： 5gatccgacttcataaggcgcatgcttcaagacggcatgcgccttat gaagtcttttttgtcgaca3，反义链为： 3gctgaagtattccgcgtacgaagttctgccgtacgcggaatacttc agaaaaaacagctgttcga5.所有的寡核苷酸片段均由上海 生工生物工程技术服务有限公司合成.退火后分别插入经 BamHI 和 EcoRI 线性化的载体 pSIREN 中，构建重组载体 pSIREN/S 和 pSIREN/CN.转化大肠杆菌 DH5，挑取氨苄青 霉素抗性菌落并扩增培养，然后快速小量制备质粒并进行 核酸测序鉴定，选择序列正确的克隆扩大培养. 细胞培养与转染 EC109 细胞株常规培养于 RPMI1640 培养基中，每 23d 经 g/L 的胰酶消化，传 代培养.采用 LipofectamineTMXX 脂质体转染法转染，操作 流程按照说明书进行.将正常培养的 EC109 细胞用胰酶消 化，1000r/min 离心 5min，以 2108 个细胞/L 重悬于培养 基，2mL/孔接种于六孔板中，待细胞生长密度约为 70%80%时， 更换无血清、无抗生素培养基.实验分为三组，即 pSIREN/S,pSIREN/CN 和未转染对照组.转染后 6h 更换正常 培养基，12h 后在荧光显微镜与流式细胞仪下观察 DsRed 的 表达，推测转染效率. 半定量 RTPCR 检测 EC109 细胞 survivinmRNA 的表达分别于转染后 24，36，48，72 和 96h 收集 pSIREN/S 细胞及 pSIREN/CN 和 未转染对照组细胞各 2106 个，PBS 洗涤两遍，提取各组 细胞总 RNA. 逆转录引物采用 Uni12 和 PolyT 进行，在 RTPCR 反应体系中加入二对引物，第一对是内源对照 GAPDH，5cgaaggtgaaggtcggagtc3和 5gaccacctggtgctcagtgt3，第二对是被沉寂的目 的基因的引物，即 survivin，5atagtcgacatgggtgccccgacgttg3和 5ctcggatcctcaatccatggcagccag3.扩增片段为 509bp.具体操作过程参照逆转录试剂盒说明书.利用 GeneTools 软件测定 GAPDH 及 survivin 的 A 值，结果以其 和内参照 GAPDH 的 A 值来反映其相对含量，确定 survivin 基因在不同时间点被 siRNA 沉寂的程度. 免疫荧光染色 生长在盖玻片上的细胞用 40g/L 多聚甲醛室温下固定 20min，g/L 胰酶、30mL/L 过氧化氢各处理 30min 后，正常 羊血清封闭 30min.加入一抗（兔抗人 survivin，SantaCruze,1200）4湿盒过夜，PBST 漂 洗后，加入二抗（Cy3 标记的羊抗兔 IgG，博士德， 1100） ，室温下染色 1h，漂洗后荧光倒置显微镜下观察并 照相. Blot 检测 EC109 细胞 survivin 蛋白的表达收集各组细胞，PBS 洗涤 2 遍，细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白，紫外分光 光度计法进行蛋白质定量.安装垂直电泳仪，配制 100g/LSDS 分离胶及浓缩胶，取 60g 样本上样.电泳后用 电转仪恒流（35mA）转移蛋白 3h 后，取出转印膜（NC 膜） ， 丽春红 S 染液染色，再经 50g/L 脱脂牛奶封闭、兔抗人 survivin 一抗 4孵育过夜，TBST 洗膜，加入 13000 羊 抗兔 IgG/HRP，室温孵育 2h，用辣根过氧化物酶/LumiGLO 化学发光法进行 Western 检测. 提取基因组 DNA，电泳观察 DNAladder 的形成 收集待测细胞用 PBS 洗 1 次.按试剂盒说明提取基因组 DNA.行 20g/L 琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下照相、观察. 流式细胞仪检测 转染细胞凋亡分别收集各组细胞 1106 个，PBS 洗涤 3 次后 700mL/L 乙醇固定，PBS 洗涤后用 2mL/LTriton100 破细胞膜，再加入 PI 染液及 RNase 避光染色 30min.流式细 胞仪检测细胞凋亡情况. 统计学处理：所有实验均重复 3 次，采用计算机统计 分析软件对半定量 RTPCR 数据进行配对 t 检验.各处理组 与正常对照组进行比较，P即认为有统计学差异. 2 结果 质粒图谱、转录产物及重组子的的鉴定 siRNA 表达载体及其多克隆位点和在 U6 启动子的作用 下所表达的小发夹 RNA（smallhairpin,shRNA，图 2）中有 19 个正义与反义核苷酸序列，两者以 9 个核苷酸的 loop 环 相连.siRNA 转录后，折叠形成如图所示的 dsRNA 发夹样结 构.pSIREN/S 采用 EcoRI 和 BamHI 进行酶切鉴定，经双酶切 后产生一个约 100bp 的片段.筛选阳性克隆质粒送测序，测 序结果完全吻合，表明构建重组子完全正确. /S 真核载体的转染及阳性克隆的鉴定 用阳离子脂质体转染法