耐药机制及检测方法

MRSA耐药机制及检测方法 府伟灵 第三军医大学附属西南医院检验科 overview MRSA，methicillin resistant Staphylococcus aureus（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌） 1961年在英国由Jevons 首次发现，是引起医院 感染的重要病原菌之一 overview MRSA是携带mecA基因、编码低亲和力青霉 素结合蛋白，导致耐甲氧西林、所有头孢菌 素、碳青霉烯类、青霉素类+青霉素抑制剂 抗生素的葡萄球菌 感染多发于免疫缺陷患者、老弱患者及手术 、烧伤后患者，极易导致感染暴发流行、治 疗困难，病死率高 overview 不均一耐药性 MRSA菌落内存在敏感和耐药药两个亚亚群，即 一株MRSA中只有一小部分细细菌约约104107 ，对对甲氧西林高度耐药药，在50 g/ml甲氧西林 条件下尚能生存，而菌落中大多数细细菌对对甲 氧西林敏感，在使用抗生素后的几小时时内大量 敏感菌被杀杀死，但少数耐药药菌株却缓缓慢生长长 ，在数小时时反又迅速增殖。 overview 广谱耐药性 MRSA除对对甲氧西林耐药药外，对对其它所有与 甲氧西林相同结结构的-内酰酰胺类类和头孢类头孢类 抗 生素均耐药药，MRSA还还可通过过改变变抗生素作 用靶位，产产生修饰饰酶，降低膜通透性产产生大 量PABA等不同机制，对对氨基糖苷类类、大环环 内酯类酯类 、四环环素类类、氟喹喹喏酮类酮类 、磺胺类类 、利福平均产产生不同程度的耐药药，唯对对万古 霉素敏感。 overview 生长特殊性 MRSA生长缓长缓 慢，在30C，培养基pH 7.0及高渗(40 g/L NaCl溶 液)条件下生长较长较 快。在30C时时，不均一耐药药株表现为现为 均一耐 药药和高度耐药药，在37C又恢复不均一耐药药。均一耐药药株在 37C或pH5.2时时，均一耐药药性可被抑制而表现为现为 敏感。增加 NaCl浓浓度，低温孵育和延长时间长时间 ，可使不均一耐药药株群体中 敏感亚亚群中的耐药药性得到充分表达，即能耐受较较高浓浓度的甲氧 西林，而对对其中耐药亚药亚 群无影响。 但最近也有报报道，高渗下延长长培养时间时间 ，会影响MRSA的 检检出结结果。因为为在高盐盐情况下，培养48 h，对对甲氧西林敏感的 金黄色葡萄球菌(methicillin sensitive Staphylococcus aureus， MSSA)易产产生大量-内酰酰胺酶，可缓缓慢水解甲氧西林，导导致细细 菌生长长，而误认为误认为 MRSA 。所以一般MRSA在高盐环盐环 境孵育 24 h，而耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)由于耐药亚药亚 群菌数少于金葡菌，应应孵育48小时观时观 察结结果。 overview 鉴于该菌对目前临床上所使用的抗生素大多 数有很高的耐药率和多重耐药性,除对甲氧西 林耐药外,对绝大多数-内酰胺类抗生素呈交 叉耐药,并可对氨基糖甙类、大环内酯类等常 用抗生素产生多重耐药，极易引起感染的爆 发流行，给临床治疗带来极大的困难，因而 成为世界关注的难题 Epidemic status 全球： 1993年，日本Kansai 医大附院MRSA 分离率为 41 % 1999年，英国30 个监测中心MRSA 检出率最高 为56.7 % 1999年，根据美国疾病控制中心(CDC) 统计， 全美重症监护病房MRSA感染率为52.3 % Epidemic status 中国： 自70年代发现有MRSA以来，近几年MRSA的 检出率正在逐年上升 1989 年，上海地区MRSA 的分离率为60 % ， 1996年激增至72% 1999-2001年，重庆地区 MRSA 分离率为65. 1% Resistance mechanism PBPs 青霉素结合蛋白（ penicillin binding proteins, PBPs)，由金黄色葡萄球菌自身合成 普通的金黄色葡萄球菌合成五种与内酰胺 类抗生素亲和力较高的PBPs，包括PBP1、 PBP2、PBP3、PBP3和PBP4 Resistance mechanism PBPs参与细菌细胞壁合成的转肽酶、羧肽酶 和内肽酶,催化糖肽交叉联接反应，对细菌的 生长繁殖起着极其重要的作用 - 内酰胺类抗生素与PBPs共价结合后，PBPs 失去活性而阻断细胞壁的合成,导致细菌死亡 Resistance mechanism MRSA染色体中含有mecA基因，另外合成一 种分子量为78kD的与-内酰胺类抗生素亲和力 较低的青霉素结合蛋白，因其电泳率介于 PBP2与PBP3之间，故称为PBP2a或PBP2 PBP2a 蛋白属高分子量PBP（78kD）,具有与 高亲和力PBPs 相同的青霉素结合基序，而结 合能力却很低，当MRSA中高亲和力PBPs结合 - 内酰胺类抗生素失活后， PBP2a可代替 PBPs，维持细菌的生长和存活，从而使MRSA 表现出耐药性 mecA基因 mec即甲氧西林耐药决定因子，是整合到葡萄球 菌上的3050kb的外来插入片段，其中mecA基因 是PBP2a的编码基因，是MRSA的主要耐药基因 mecA基因存在于MRSA和部分凝固酶阴性葡萄球 菌( coagulase negative staphylococci ,CNS or CoNS)中，mec片段末端存在末端反向重复序列， 且均插入到环状染色体的SmaIG部位编码A蛋 白的spa基因和腺嘌呤生物合成必须的purA基因 之间，具有位置特异性 mecA基因 mecDNA片段（52kb）是可移动的遗传元件， 命名为葡萄球菌染色体mec盒（staphylococcal chromosomal cassette mec ，SCCmec），包 括mec及ccr基因复合体 SCCmec可以以多种的插入方式插入到其它的 染色体和质粒中，使耐药性进行水平性的转移 或者在不同家系的葡萄球菌间传播 影响mecA表达的因素 mecA基因的基本调节基因为mecI和mecR1 mecI基因编码mecI蛋白为抑制因子，当其 结合到mecA基因的启动子上时，抑制mecA基 因地转录，从而不能产生PBP2a mecR1基因编码mecR1蛋白为诱导因子， 当其接触到诱导剂-内酰胺类抗生素时被活化 ，活化的mecR1蛋白能够去除mecI蛋白对 mecA基因地阻遏作用，使mecA编码产生 PBP2a蛋白 影响mecA表达的因素 mecA基因的5端的核苷酸序列与编码-内酰 胺酶的blaZ基因具有同源性，mecA基因的表 达也受到-内酰胺酶诱导基因blaI和bla R1的 共同调节，但相对于mecI和mecR1基因作用 较弱 影响mecA表达的因素 温度、pH值、盐离子浓度对mecA基因的表 达亦有影响 研究表明，温度3035，pH值7.0 7.2，盐浓度4时mecA基因表达最强， PBP2a产量最多（MIC最高） 其他耐药相关基因 携带mecA基因的MRSA耐药性有很大的差异（ MIC为162000mg/L） 将转座子Tn551插入到高度耐药的MRSA菌株染色 体中，其PBP2a的表达量没有变化，而对-内酰胺类抗 生素的敏感性显著提高 说明存在除mec基因之外地其它耐药相关基因 其他耐药相关基因 fem基因 fem因子（factors essential for meticillin resistance），是金黄色葡萄球菌染色体中的 固有基因，包括femA、femB、femC、femD 、femE、femF。 hmrC、hmrD和chr基因 是染色体突变基因，引起MRSA对甲氧西林 的高度耐药，其机制尚未阐明 fem基因 1 femA和femB为两个相 连的开放阅读框，对细 菌细胞壁的五甘氨酸侧 链以及肽间桥的生物合 成是必需的。当其失活 时， MRSA对-内酰 胺酶类抗生素以及多种 其它类抗生素的耐药性 降低 2 femC的作用引起谷氨 酰胺合成酶基因glnA 转录和活化及异谷氨酰 胺的酰胺化，其失活时 ，糖肽的交叉连接降低 ，MRSA对-内酰胺酶 类抗生素耐药性降低 2 femF基因的编码产物 涉及L-赖氨酸与胞壁酰 二肽链的连接，其突变 失活时引起的耐药性的 改变得具体机制还有待 研究。 femD和femE对细菌的 确切作用还未阐明 Detection for MRSA MALDI- TOF MSMALDI- TOF MS细菌指纹图谱法细菌指纹图谱法 传统方法传统方法 药物敏感试验方法 NCCLS推荐使用药 敏纸片法、苯唑西林 (oxacillin)盐琼脂筛 查法、-内酰胺酶检 测、E-test 试验和试 管双倍稀释法等 缺点：易受培养基成 分影响，较耗时，且 错误应用抗生素会引 起更为严重耐药的耐 药菌株的出现 快速乳胶(Latex) 凝集 法PBP2a 单克隆抗体 致敏的乳胶颗粒与 MRSA 的膜蛋白提取 物作用,产生肉眼可见 的凝集颗粒,证实有 PBP2a 的存在,以此 判断该菌为MRSA 此法简便、快速、准 确,检测1 份标本只需 15 min，和PCR法一 样有极高的灵敏度和 特异性，有较好的应 用前景 免疫学方法 基质辅助激光解吸电 离-飞行时间质谱 可 简易分析低纯度的固 体混合物样品, 检测 范围可到350 KD 。 根据细菌的全细胞图 谱差异，鉴定未知细 菌。耗时少，重复性 高 缺点：要求特殊仪器 ，结果处理方法复杂 ，不适于普遍开展 分子生物学方法分子生物学方法 分型方法 传统方法是噬菌体分型技术,根据分离 菌株对各噬菌体的敏感性和噬菌体裂 解情况进行分型。目前采用的一些分 子生物学进行基因分型的方法有：脉 冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis , PFGE)、逆向凝胶 电泳(field inversion gelelectrophoresis ,FIGE) 、随机扩 增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、 多位 点序列分型（multilocus sequencing typing，MLST）等 PCRPCR法法 mecA 基因高度保守,根据其核 苷酸序列设计不同的引物,用 PCR对菌株中PBP2a 靶DNA 特定片段mecA 进行扩增,以 mecA 基因存在与否判定是否 为MRSA 菌株，不受药敏实验 条件的影响,因而特异性高,被 公认为是其诊断的金标准。 mecA和femB 基因表达均为阳 性,方能确诊为MRSA MRSA的治疗和预防 MRSA的治疗 万古霉素是目前临床上治疗MRSA唯一疗效肯 定的抗生素 NCCLS规定：万古霉素敏感4 g/ml，中介8 16 g/ml，耐药32 g/ml， MRSA的治疗和预防 万古霉素一种三环糖肽类抗菌药物，它和细 菌中的另一种分子（细胞壁肽聚糖前体五肽 ）结合而抑制细菌细胞壁蛋白合成，和破坏 细胞膜及阻碍细菌RNA合成的多种作用，因 此使用万古霉素仍然可以杀死MRSA。但是 滥用万古霉素则会产生别的抗药病菌，最常 见的是耐万古霉素肠球菌 MRSA的治疗和预防 随着万古霉素的广泛使用，也许不久也会出 现耐万古霉素的MRSA，因此现在就必须适 量地慎用万古霉素 除万古霉素外，还有壁霉素、香豆霉素等新 药对MRSA有较强的抗菌活性。另外，万古 霉素也可与磷霉素、利福平、氨基糖苷类、 喹诺酮类药物合用，加强治疗效果 MRSA的治疗和预防 自2002年美国报道了第1株耐万古霉素的金黄 色葡萄球菌以来,先后出现3株VRSA。我国尚 无耐万古霉素金葡菌的报道，如万古霉素对 MRSA治疗无效, 后果将不堪设想 细菌的抗药性是不可避免的，但并不是不可 以控制的，导致超级病菌流行的重要原因是 滥用抗菌药物。 MRSA的治疗和预防 目前临床滥用抗 生素的现象，对 MRSA的流行起 了一定的扩散作 用 ，第三代头孢 菌素的长期使用 与MRSA的出现 率呈平行关系 医护人员检查病 人前后要严格洗 手消毒，有条件 应用一次性口罩 、帽子、手套， 医疗用品要固定 ，