3株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌临床株耐药机制的研究(1)

3 3 株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌临床株耐株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌临床株耐 药机制的研究药机制的研究(1)(1) 作者：钱洁宋诗铎祁伟王玉宝 【摘要】目的研究鲍曼不动杆菌对碳青霉烯耐药的分 子机制。方法采用琼脂纸片扩散法及微量肉汤法筛选出 3 株对碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌临床株，PCR 扩增 blaOXA23 基因和测序、提取外膜蛋白及进行聚丙烯酰胺 凝胶电泳。结果 3 株耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌具有多重 耐药性；耐药基因 PCR 扩增和测序证实 3 株耐药菌均有 blaOXA23 基因；其中 1 株耐药菌 AB173 的外膜蛋白电泳 条带在处出现明显缺失，其余 2 株耐药菌在该条带处与敏 感菌相比较无明显差异。结论本次试验中对碳青霉烯耐药 的鲍曼不动杆菌全部含有 blaOXA23 基因，其中一株耐药 菌还出现了外膜蛋白孔道的缺失可能与其多重耐药性有关。 【关键词】鲍曼不动杆菌多重耐药 blaOXA23 基因外膜 蛋白聚合酶链反应 Themechanismofthreecarbapenemresistantclinicaliso lates ofAcinetobacterbaumannii ABSTRACTObjectiveTostudythemolecularmechanismofcarb apenemresistantAcinetobacterbaumannnii.MethodsThe carbapenemresistantstrainsweredetectedfromclinica lisolatesAcinetobacterbaumanniibydiskdiffusionandmi crodilutedbrothmethod.TheblaOXA23genewasamplifi edbyPCRmethodandthensequenced.Theiroutmembraneprote inswereextractedandanalyzedbyusingSDSpolyacrylami degelelectrophoresisandacarbapenemsusceptibleAcin etobacterbaumannniistrainascontrol.ResultsThePCRamp lificationandsequencingresultsshowedthatthethreemul tiresiltantAcinetobacterbaumanniiisolatesweremult iresistantandallcarriedblaOXA23gene.TheSDSPAG Eelectrophoresisresultshowedthatbanddeficiencywas foundinAB173,whereasothertworesistantisolatesshowed thesameelectrophoresisprofileswiththecontrol.Conclu sionsInthisexperiment,allthreecarbapenemresistant AcinetobacterbaumanniistrainscarriedblaOXA23genea ndoneofthemlackedaOMP,whichwereprobablyattributedto themultiresistanceoforganisms. KEYWORDSAcinetobacterbaumannii;Multiresistance;bl aOXA23gene;Outermembraneprotein;Polymerasechainre action 在过去的几十年内，ICU 病房中有创性检查及治疗的增 加使得不动杆菌成为重要的条件致病菌，它可以导致广泛 的临床并发症，例如肺炎、败血症、泌尿系感染、伤口感 染、脑膜炎，尤其易发生在免疫功能低下的患者身上1 。 由于不动杆菌对氨基糖苷类、内酰胺类等多种抗生素 耐药，因此限制了治疗时对敏感药物的选择，给临床治疗 带来了巨大的压力。研究显示鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类 抗生素耐药机制涉及产碳青霉烯酶、外膜蛋白缺失、外排 泵系统表达亢进和青霉素结合蛋白突变等诸多方面。本试 验收集了近期 3 株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌临床株并对其 产 OXA23 型碳青霉烯酶和外膜蛋白的情况进行研究。 1 材料与方法 材料 菌株来源和菌种鉴定 XX 年从天津医科大学第二医院住 院患者分离的 3 株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌临床株，标本 编号为 AB13、AB24、AB173，分别来源于不同患者的痰标本。 菌株鉴定采用 API20NE 试纸条，对照菌株为对碳青霉烯敏 感的鲍曼不动杆菌临床株 AB942，质控菌株大肠埃希菌 ATCC25922 和嗜麦芽寡养单胞菌临床株 Sme006 均为本研究 室保存。 试剂抗生素标准品头孢哌酮、头孢哌酮/舒巴坦购自 Pfizer 公司；左氧氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、阿米卡 星、哌拉西林、头孢噻肟、庆大霉素购自中国药品生物制 品检定所；亚胺培南、美罗培南和哌拉西林/三唑巴坦纸片 购自中国药品生物制品检定所；头孢曲松、头孢吡肟、头 孢他啶分别购自 Rochs 公司、Squibb 公司、Lilly 公司； PCR 相关试剂购自上海生工。 药物敏感试验 采用琼脂纸片扩散法及微量肉汤法测定 MIC 值。试验 方法及药敏判断标准参照美国临床实验室标准化研究所 XX 年版的标准。 菌体 DNA 的提取 细菌基因组 DNA 参照 PitoutJDD 方法提取，提取的 DNA 经 A260/A280 测定符合质量标准，在-20保存。 blaOXA23 基因的 PCR 扩增和序列分析 采用引物设计软件及参考 Donald 等文献2合成引 物，上游引物 SQ15GATGTGTCATAGTATTCGTCG3， 下游引物 SQ25TCACAACAACTAAAAGCACTG3，预期 PCR 产物大小为 1067bp 片断，涵盖了 blaOXA23 基因编码 序列。PCR 反应条件：第一循环变性温度 94240s，退火 温度 5060s，延伸温度 7260s；30 个循环 94 45s，5060s，7260s，最终延伸时间 360s。PCR 产物经%琼 脂糖凝胶电泳检测，QuantityOne 成像软件进行条带分析， 纯化 PCR 产物送交上海生工测序。 细菌外膜蛋白的制备 采用月桂酰肌氨酸钠方法提取 OMP3 ，主要步骤如下： 取新鲜菌落在 30LB 培养基中生长过夜，离心后重悬于新 鲜的 PBSPMSFDTT 的混合液中，超声细胞粉碎仪在冰水浴中 破碎细菌，4离心 10min，取上清液加入月桂酰肌氨酸钠 溶液，20孵育 30min，超速冷冻离心 2h，沉淀用%月桂酰 肌氨酸钠溶液洗涤一次，最后将称沉淀悬浮于 TrisEDTASDS 混合液中为 OMP 样本液，4保存备用。 SDSPAGE 分析 取 OMP 样本液 30l 加入 10l 的 2上样缓冲液， 100煮沸 35min，同样的方法处理低分子量蛋白分子量 标准品。取 40l 处理后