生物合成ppt课件

第 五 章 DNA 的 生 物 合 成 术语简介 l基因和蛋白质的命名缩写： 1）基因通常用3个能反映其基本功能的 斜 体小写字母表示。如：dna 基因影响DNA 的 复制，rec 基因影响DNA的重组。 当几个基因影响同一过程时，通常按 发 现的先后顺序加上A、B、C等。 2）对基因的蛋白质产物命名，不用斜 体，且第1个字母大写。如：dnaA和recA基 因的产物叫做DnaA和RecA 。 l模板（template）: 一种使分子能按一定顺序 排列并连接形成有特定序列和功能的生物 大 分子的结构。 第一节 原核生物的DNA复制 一. DNA的半保留复制 DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链 ，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成 与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链 从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新 合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列 一致。这种复制方式称为半保留复制。 半保留复制 亲 代 第 一 代 第 二 代 半保留复制的实验证据 1958年Meselson 和Stahl用同位素15N标 记大肠杆菌DNA，首 先证明了DNA的半保 留复制。 重 轻 杂和 DNA 杂和 DNA 新链 旧链 DNA的半保留复制 的生物学意义： 按半保留复制方式，子 代DNA与亲代DNA的碱 基序列一致，即子代保 留了亲代的全部遗传信 息，体现了遗传的保守 性. 遗传的保守性，是物 种稳定性的分子基础， 但不是绝对的。 子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式 半保留式 混合式 二. 复制的起点和方向 复制是一个高度协调的过程，母链解链和复 制同时进行。 （一）概念 复制子(replicon)：基因组能独立进行复制的单位。 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制 子. 起点(origin)：控制复制起始，是含有100200个碱基 对的一段DNA。细胞内存在着能识别起点的特殊蛋 白质(大肠杆菌中称为Dna A蛋白)。 终点(terminus)：终止复制的序列位点. 复制叉(replication fork)：复制开始后由于 DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形 成在显微镜下可看到的叉状结构。 A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter) ori ter A B C 原核生物：只有一个复制子 真核生物：多个复制子，多个起点，形成多个 “复制眼”或“复制泡” 5 3 oriorioriori 5 3 5 5 3 3 5 5 3 复制子 3 （二）起始点和方向 1. 原核生物和真核生物复制都是在DNA分子 特定的位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的 保守顺序GATC和TTATCCACA，多次出现， 可被酶识别。 2. 方向：大多是双向、对称复制, 也有单向或 不对称的。 3. 速度： 原核生物复制叉移动快(约105bp/min); 真核生物复制叉移动慢 (约51025103bp/min) 双向复制 复制叉 起点 起点 单向复制 复制起始点、复制子与复制叉（动画演示） 三. 原核细胞DNA的复制(DNA指导下的DNA合成 ) （一）DNA聚合酶 ( DNA polymerase, DNA-pol ) lDNA聚合酶是一种催化依赖模板的由脱氧核 苷三磷酸前体合成DNA的酶。 l1956 年 Arthur kornberg 等首先从大肠杆菌 中发现DNA聚合酶，其后在不同的生物中都找 到有这种酶。 DNA聚合酶的反应特点： 4种dNTP底物：(dATP dGTP dCTP dTTP) ； 接受模板指导: 解开成单链的DNA母链； 需引物提供3-OH； 新链生长方向： 53； 产物DNA性质与模板相同。 此外, DNA复制过程中还需其它酶和蛋白质因 子. 模板DNA链 引 物 新加入的dNTP 脱氧核糖 亲核攻击 53 生长的DNA链 * 引物 (primer) 是一和模板链互补的线性片段, 其上带有 能与核苷酸相结合的游离3-OH. 引物通常是寡聚RNA. 1. 大肠杆菌DNA聚合酶 pol 也称Kornberg酶, 是各种DNA聚合酶中研 究 的最透彻的，它的一些特点代表了DNA聚合酶 的基本特点： （1） pol 的性质 分子量：103 000，单链，球形，活性部 位含 Zn2， 电镜下可以看到二聚体，每个 细胞有400个酶分子。 功能：对复制中的错误进行校读，对复制和 修复中出现的空隙进行填补。 DNA-pol （109kD） 323个氨基酸 小片段 5 核酸外切酶活性 大片段/Klenow 片段 604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 N 端C 端 木瓜蛋白酶 DNA-pol Klenow片段是实验室合成DNA，进行 分子生物学研究中常用的工具酶。 （2）功能： 53聚合酶活性； 酶与模板结合后构象改变，识别碱基，正 确配对后才发挥聚合作用 3 5外切酶活性； 主要是对新生DNA链进行校对，防止“错配 ” 53外切酶活性。 主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复 制 时RNA引物的切除及其空隙的填补 可见，DNA pol是1个多功能酶 模 板 聚合酶活 性位点 引物 3 5 外 切酶位点 2. 大肠杆菌DNA聚合酶 pol (1) 多亚基, 聚合酶亚基 (单链) 分子量为88 000, 每个细胞有100个酶分子 （2）功能： 53聚合酶活性； 35外切酶活性。 （该酶无53外切酶活性;且活性低） 目前认为该酶主要参与DNA损伤的修复。 3. 大肠杆菌DNA聚合酶 pol 真正的DNA复制酶，1972年发现 （1）pol 是真正起复制作用的酶，由10种 亚基组成不对称二聚体, 、组成核心酶 （2）功能： 53聚合酶活性； 35外切酶活性。 该酶在原核细胞中主要负责DNA链的延伸， 是 复制延长中真正起催化作用的酶。 (该酶无53外切酶活性) E. coli DNA 聚合酶不对称二聚体 可滑动的 夹持器亚基 催化亚基 35外切酶亚基 前导链 合成 后随链 合成 夹持器 装置 催化亚基 亚基保持核心酶 的二聚体结构 亚基具有53方向合成DNA的催化活性 亚基具有35外切酶活性，起校对功能， 可提高聚合酶复制DNA的保真性 亚基可能起组建的作用 亚基犹如夹子，功能是识别引物、夹住DNA 分子向前滑动 亚基起着促使核心酶二聚化的作用 其余的亚基构成 -复合物，主要功能是帮助 亚基夹住DNA（也称夹子装置器），并有 增强核心酶活性的作用 DNA 聚合酶 pol pol pol 亚基数目 1 7 10 5 3 聚合酶活性 + + + 3 5 外切酶活性 + + + 5 3 外切酶活性 + - - 聚合速度(核苷酸/分) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000 持续合成能力 3-200 1 500 500 000 功能 切除引物,修复 修复 复制 表 大肠杆菌3种DNA聚合酶性质比较 1、冈崎片段和半不连续复制 （1）冈崎片段(Okazaki fragment)： 在不连续的后随链DNA合成中形成的 DNA短片段，在原核生物有10002000核苷 酸，真核生物约100200核苷酸。1968年冈 崎发现。 （二）双链DNA复制的分子机制 （2）DNA的半不连续复制: DNA双链复制时，一条链是连续合成的(前 导链, leading strand), 另一条链是不连续合成的( 滞后链或后随链, lagging strand), 这种前导链的 连续复制和后随链的不连续复制方式称DNA的 半不连续复制。 3 5 3 5 35 3 5 解链方向 领头链 (leading strand) 后随链 (lagging strand) DNA的半不连续复制 3 5 复制叉 起点 复制叉 延伸延伸 起点 领头链 领头链 随后链 随后链 35 3 5 DNA的双向复制 5 5 55 5 5 5 5 3 3 33 3 3 3 2、DNA半不连续复制中的RNA引物 （1）前导链和滞后链的合成都需要RNA引物 。 （2）引物合成酶(Dna G)：是以DNA为模板的 RNA聚合酶（合成方向53）, 合成的引物 长度为510nt。 (3) 引物RNA的起始和终止的位置受解链酶、 引发酶、模板顺序及其二级结构的影响。 （4）DNA聚合酶切除前导链及冈崎片段的 引 物后, 填补空缺，由DNA连接酶将切口连接。 RNA引物的合成称作“引发” 。 后随链的合成需多次引发作用，而发动前 导链的合成只需一次引发。 前导链的引物一般比冈崎片段的引物略长一 些，前者大约为1060nt，后者通常为几个10 多个nt。 成熟的DNA是不含RNA的，RNA引物最终 被 DNA所置换。 3、DNA连接酶（ligase） 催化两段DNA之间的连接: 3 5 5 3 5 3 5 3 HO P DNA ligase NAD ATP NMN AMP+PPi + DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中 一 条链有切口, 一端是3-OH, 另一端是5-磷酸基, 连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口 连接。 但它不能将两条游离的DNA单链连接起来。 大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶需要 NAD+ 提供能量;在高等生物和噬菌体中，则要ATP提供 能量。 3 5 3 5 OHP 4. 母本DNA双链的分离 (1) DNA解链酶(解螺旋酶, Dna B)：通过水解 ATP将复制叉前方的DNA双链打开。每解开一对 碱基需要水解2个ATP分子。 (2) 单链结合蛋白(SSB)：稳定已被解开的DNA 单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。 (3) DNA旋转酶或拓扑异构酶: 兼有内切酶和 连接酶活性, 可迅速使DNA两条链断开又接上, 消 除解链酶产生的拓扑张力。当引入负超螺旋时需 要由ATP提供能量, 同复制有关。 总结: 原核生物DNA的复制过程:(以大肠杆菌为 例) 双链的解开 起始-RNA引物的合成 DNA链的延伸 终止 B. RNA引物的合成 引发体先与DNA起始部位双链结合，通过 引物合成酶形成前导链引物后，再沿53模 板链与复制叉同向移动，在移动中断断续续 形成冈崎片段的RNA引物。 A. 双链的解开 DNA旋转酶(拓扑异构酶)、 DNA解链酶、 单链结合蛋白协同作用 C. DNA链的延伸 在DNA pol 的催化下，以四种dNTP为底 物，在RNA引物的3 端以磷酸二酯键连接上脱 氧核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时 进行领头链和后随链的合成。 5 3 5 dATPdGTPdTTP dCTP dTTP dGTPdATP dCTP OH 3 3 DNA-pol 前导链的延长： DNA pol 全酶二聚体的一个亚基与前导链 的模板结合而发挥催化作用，与复制叉同向。 滞后链的延长: DNA pol 全酶二聚体的另一亚基与形成一 个环的滞后链的模板结合发挥催化作用。 由于模板形成环, 酶向前移动时, 滞后链合成 片段也沿53方向生长, 与酶催化方向一致。 滞后链片段合成接近前方滞后链片段5末端 时, 模板被释放, 环消失。继续重复, 连续进行 。 DNA聚合酶催化领头链和随从链同时合成 当新形成的冈崎片段延长至一定长度, 其 3-OH遇到上一个冈崎片段时即停止合成。 一旦冈崎片段合成完成，其RNA引物即被 除去，通过DNA聚合酶催化合成DNA取而代 之，并形成一个切口，此切口由DNA连接酶连 接封闭。 D. 复制终止 细菌环状染色体的两个复制叉向前推移，在 终止区相遇而停止复制，复制体解体。 这样, 以两条亲代DNA链为模板，各自形成 一条新的DNA互补链，结果形成了两个DNA双 股螺旋分子。 就目前所知，起始阶段是DNA复制中唯一一 个可以受调节的阶段，由于受到调节而使得DNA 在一个细胞周期中只发生一次复制。 细菌复制终止区含有多个约22bp的终止子 (terminator)位点，E. coli 有7个终止子位点。 复制的保真性 ( fidelity ) 主要依赖 3 种机制： 聚合酶对碱基的选择； 3 5方向的外切核酸酶活性起校正作用; 复制后错配现象的特异性修复机制。 5. DNA聚合酶的“校对”(proofreading)作用 大肠杆菌DNA复制错配率约10-910-10。其染 色体中有4.5106bp，平均每1 00010 000个细 胞经过一次分裂才会插入一个不正确的碱基。 小结维持DNA复制准确性的因素： 内因: 按碱基配对原则 (错配率10-410-5) DNA聚合酶的作用 (错配率10-410-5) 对碱基的识别作用-选择正确的碱基 参 入到引物末端 对底物的识别作用-先识别引物最后 一个碱基是否正确, 后识别参入的dNTP是否正确 校正阅读- 3 5外切酶的作用 RNA引物最终被切除, 提高了复制准确 性 复制完成后对错配碱基进行修复的酶系 统 外因： 四种dNTP要平衡； Mn2+和Mg2+的比例、浓度（酶活） (一) 真核生物的DNA聚合酶:至少5种- DNA-pol 现认为其功能只是合成引物 DNA-pol 在复制延长中起催化作用 DNA-pol 校对、修复、填补(类似E.coli DNA pol I ) DNA-pol 线粒体DNA合成 DNA-pol 核DNA修复 四、真核细胞DNA的复制（DNA指导 下的DNA合成） 推测在复制叉上有一个DNA pol, 以合成引物; 两个DNA pol, 分别合成前导链和滞后链。 （二）真核生物中DNA的复制特点 1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双 向复制，多复制子。 2、冈崎片段长约200bp. 3、真核生物DNA复制速度比原核慢。 4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开 始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发 动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复 制起点。 5、真核生物有多种DNA聚合酶。 6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体 间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5端RNA引 物切除后的填补，亦保持端粒的一定长度。 端粒 端粒 中心粒 图 真核生物染色体 端粒 (telomere) 是真核生物线性染色体的两 个末端所具有的特殊结构, 其共同特点是一条链 上富含 T、G 短序列的多次重复, 而其互补链上 富含A、C。 （三）端粒的复制 端粒主要有两大生理功能： l （1）维持染色体结构的完整性，防止染色体被核 酸酶降解及染色体间相互融和。 l （2）防止染色体结构基因在复制时丢失，解决了 末端复制的难题。 l DNA复制时，DNA聚合酶必须在RNA引物基础 上从5向3方向延伸，而5端RNA引物去除后因无引 物的存在而不能复制，结果每复制一次染色体末端将 丢失一段序列。端粒的存在使每次丢失的仅为端粒的 一部分，从而保护了染色体内部的结构基因。另外， 有些研究还显示，端粒与核运动有关，可能对同源染 色体的配对重组有重要意义。 l 端粒的合成主要依靠端粒酶来催化。 l 线性DNA在复制完成后，其末端由于引 物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒 酶（telomerase）的催化下，进行延长反应 。 5 3 3 5 5 3 3 5 端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体,它可以其RNA 为模板, 通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。 端粒酶的爬行模型（动画演示） 母链藉非标准碱基配对回折 DNA聚合酶 端粒合成完成 进一步加工 如上图所示, (a)端粒酶以其RNA为模板, 通过逆转录 作用, 催化富含G链的延伸; (b)端粒酶向端粒新3端移动, 继续以其RNA为模板, 催化富含G的DNA母链延长; (c) 端粒酶反复移位, 通过逆转录反应使端粒富含G链增长 到足够长度; (d)富含C链的空缺部分不需要引物酶合成 引物提供3-OH, 而是富含G的链突出的寡脱氧核苷酸 d(GGGGTTTTGGGG)通过非Watson-Crick配对方式自 身的GGGG之间按G G配对, 回折形成发卡并提供3- OH; (e)由发卡引发富含C链在3-OH以富含G链为模板, 由DNA聚合酶添加新的dNTP, 进一步延伸填补空缺, 间 隙最后由DNA连接酶封口; (f)端粒DNA与端粒蛋白结合, 完成加工后, 形成完整的端粒。 第三节 DNA的损伤修复 DNA的损伤：DNA在复制时产生错配、病毒基因整合 ，某些理化因子如紫外线、电离辐射和化学诱变等， 破坏DNA的双螺旋结构，从而影响DNA的复制，并 使DNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常 的特征（生物突变）。 引发突变的因素 物理因素 紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射 UV 化学因素 目 录 突变分子的改变类型 错配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入 (insertion) 重排 (rearrangement) 框移 (frame-shift) DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。 发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另 一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1. 转换 发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶 或嘧啶变嘌呤。 2. 颠换 （一）错配 镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基 N-val his leu thr pro val glu C 肽链 CAC GTG 基因 正常成人Hb (HbA)亚基 N-val his leu thr pro glu glu C 肽链 CTC GAG 基因 （二）缺失、插入和框移 缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上 消失。 插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入 到DNA大分子中间。 框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造 成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。 缺失或插入都可导致框移突变 。 谷 酪 蛋 丝 5 G C A G U A C A U G U C 丙 缬 组 缬 正常 5 G A G U A C A U G U C 缺失C 缺失引起框移突变 （三）重排 DNA分子内较大片段的交换，称为 重组或重排。 由基因重排引起的两种地中海贫血基因型 目 录 四、DNA损伤的修复 修复(repairing) 是对已发生分子改变的补偿措施，使其 回复为原有的天然状态。 光修复(light repairing) 切除修复(excision repairing) 重组修复(recombination repairing) SOS修复 修复的主要类型 （一）光修复 400nm左右的光激活光复活酶，专一分解 紫外光照射引起的同一条链上的TT（或CC，CT）二聚体 光修复酶 (photolyase) UV UvrA UvrB UvrC OHP DNA聚合酶 OH P （二）切除修复 是细胞内最重要和有效 的修复机制，主要由DNA- pol和连接酶完成。将DNA 分子中的受损伤部分切除，以 完整的那条链为模板再重新合 成。特异内切酶、DNA聚合 酶、 DNA外切酶、DNA连接 酶均参与。（发生在DNA复 制前） DNA连接酶ATP E.coli的切除 修复机制 目 录 （三）重组修复（发生在复制后）：复制时， 跳过损伤部位，新链产生的缺口由母链弥补，原损 伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释。 （四）SOS修复 当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱 发出一系列复杂的反应。 在E. coli，各种与修复有关的基因，组成一个 称为调节子(regulon)的网络式调控系统。 这种修