mrna差异显示方法研究进展(1)

mRNAmRNA 差异显示方法研究进展差异显示方法研究进展(1)(1) 哺乳动物细胞约有 100?000 个不同的基因，在一定时 间、空间中仅有 1015的基因表达，这种表达受到严 格调控1 。运用 mRNA 差异显示 （differentialdisplay,DD）方法2 ，可将不同细胞类 型或同一细胞在不同环境下表达的基因进行比较，从分子 生物学水平上提供信息，这对理解细胞的生命过程极有帮 助。该技术一经问世，立即得到广泛应用，但同时也遇到 许多问题，所以 Debouck3曾对该方法提出质疑。现将 DD 的研究进展简要综述如下。 一、DD 方法基本原理 DD 的基本原理是将具有可比性的细胞在某一条件下可 表达的 mRNA 群体通过逆转录方法变成相应的 cDNA 群体， 以此为模板，利用一对特殊引物，即 3anchor 引物和 5arbitrary 引物，在一定条件下进行 PCR 扩增，得到与 mRNA 相对应的“标签” （tags） ，然后用变性聚丙烯酰胺测 序胶分析其差别，将有差别的基因克隆化，进一步分析其 结构与功能。DD 依赖三种技术：（1）mRNA 逆转录技术； （2）以特定引物进行的 PCR 技术；（3）DNA 测序胶电泳技 术。 二、DD 方法的优点及其应用 用某一方法来寻找 mRNA 表达的差异，至少要满足下列 要求：（1）在一定时间、空间里，每一个细胞约有 15000 种 mRNA 表达，其中除少数属高丰度表达外，大量的属于低 丰度表达，即要求使用的方法足以显示低丰度 mRNA；（2） 重复性要好；（3）实验过程中能够步步验证比较（side- by-sidecomparison） ；（4）得到的产物能代表相应的 mRNAs 或 cDNAs，并能由此找到相应的 cDNA 序列；（5）省 时，简便易行。 既往对 mRNA 的比较研究中多用减数杂交方法4 （subtractionhybridization） ，该方法灵敏，可显示低丰 度 RNA，但是步骤复杂，需时较长，而且在得到最终结果前 无法步步验证对照比较，故不易重复，并且需要大量的 RNA 作起始研究材料。这一点对 RNA 来源不易者（如手术活检 标本）极不利5，6 。 DD 的优点在于：（1）仅需 g 总 RNA 作为起始材料； （2）可同时分析多组样品；（3）敏感性高，可检出低丰 度 mRNA；（4）实验周期短，约 8 天即可完成7 ，便于重 复；（5）最突出的优点是实验过程中可步步验证比较。可 简单地将 DD 的特点概括为“3SRV” ，即 “Simplicity，Sensitivity，Speed，Reproducibility， Versatility” 。 DD 方法因有上述优点，被广泛应用。例如：Musholt 等8应用 DD 方法对手术切下的髓样甲状腺癌标本与局 部转移的淋巴结进行了比较，发现了两个新的表达基因 MDF-1 和 MDF-2，并认为这两个基因在髓样甲状腺癌的进展 与转移中起了重要作用；Zuo 等9研究溃疡性结肠炎的 粘膜细胞，以正常结肠粘膜细胞作对照，找到了 25 个表达 基因，其中有些与甲状旁腺瘤、T 细胞受体-、卵巢癌等 表达的基因同源。 关于神经再生问题，Livesey 等10发现了 Reg-2 基 因，并认为该基因是哺乳类动物运动神经元再生的关键基 因。 在骨科领域，也有许多用 DD 方法的研究，Ryoo 等 11找到了一个与成骨细胞表型发育有关的细胞增殖标 志基因 PROM-1（proliferatingcellmarker） 。更令人鼓舞 的是，Boden 等12用一种新的骨形成蛋白 LMP-1 基因转 染骨髓细胞，再作局部基因治疗，在动物实验中成功地进 行了脊柱融合，LMP-1 基因就是用 DD 方法克隆出来的。 此外，DD 还应用于心血管病13 、糖尿病14 、胚 胎发育15 、先天性疾病16以及药理学17和眼科 学18等。不仅用于动物和人类，还应用于植物分子生 物学研究19 。 三、存在的问题与对策 DD 方法存在的问题概括起来有两方面：一是假阳性多 （约 5070） ，二是得到的有差异 cDNA 片段短（约为 110500bp） 。因为这两个问题，使许多研究者踟蹰不前， 这也是 Debouk3提出质疑的原因之一。 产生假阳性的原因，在于以下 4 个环节：（1）提取总 RNA 时，有染色体 DNA 污染，此 DNA 作为模板在 PCR 过程中 被扩增；（2）从聚丙烯酰胺胶上挑选有差异条带时，实验 组与对照组间信号对比不够显著；（3）在克隆阶段挑选阳 性菌落时，未能排除基因克隆中的假阳性；（4）研究中多 次使用 PCR 技术，很难避免实验室环境中的交叉污染。 解决这一问题的对策是：（1）提取 RNA 操作严格，得 到的 RNA 必须经过脱氧核糖核酸酶 I 充分消化，去除染色 体 DNA 污染。 （2）从聚丙烯酰胺胶上切取有差异条带时， 首选实验与对照间信号差异显者，最好是互为有或无的关 系；如果仅仅是强与弱的关系，放在次选位置上。 （3）即 使是差异显著地显现为一条带，也不能肯定是由某一 cDNA 的均一分子泳动而成，有可能是结构不同而分子量相同的 cDNA 共泳动（Co-migrat）的结果。对此，可用 mSSCP 方法 区别开来7 。也可在基因克隆挑选时，用 Reversenorthern 原理作菌落原位杂交进行筛选20 。 （4）关于交叉污染问题的克服应服从分子生物学一般原则。 （5）有差异基因的最终确认是用 Northern 杂交，如果选 取了十几或几十条差异条带，用 Northern 杂交工作量太大， 若用 Reversenorthern 杂交则比较简便20 。 DD 扩增片段较短，且扩增片段多位于 3UTR（3untranslatedregion）范围内，很少能扩增到 ORF（openreadingframe）范围内。这一缺点是由使用的特 殊引物所决定的，因此 DD 得到的是 mRNA 的标签（tags） ； 由此带来另一个问题，即这一位于 3UTR 范围的标签与 Genebank 数据库比较时，多数情况是与 EST（expressionseguencetags）比较，常不能满足研究者 的要求。 解决这一问题的对策是：（1）应用 TargetedDD 方法， 基本原理是将 5端引物延长，增加扩增片段的特异性 21，22 ；或者用 Stone 和 Wharton23报道的 “targetedrNAfingerprinting”方法。这样有可能使扩增 片段特异性高，减少假阳性率，同时可能在 Genebank 数据 库中得到更多结构与功能方面的信息；（2）用得到的 cDNA 片段作 probe 筛选相应 cDNA 文库，得到 cDNA 全序列，以 便于基因结构与功能研究。 四、展望 了解细胞在某一条件下的基因表达，对阐明生命过程 以及炎症、肿瘤、心脑血管疾病等病理过程极为重要。DD 方法在应用中被不断完善，同时也有更新的技术问世，如 DNAmicroarrays24 ，把大量寡核苷酸片段排列在相似于 一种大规模集成电路式的生物芯片上，一次可完成数量相 当可