pspa免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染研究(1)

PspAPspA 免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染 研究研究(1)(1) 作者：胥文春，曹炬，许颂霄，罗进勇，朱旦，尹一 兵 【摘要】目的：获取原核表达的肺炎链球菌 PspA 重组 蛋白并研究其作为疫苗的价值.方法：分离培养肺炎链球菌 TIGR4，获取其染色体 DNA，采用基因体外重组法将编码 PspA 抗原表位在内的部分序列克隆到原核表达载体 PET32 内，酶切及测序鉴定重组质粒转化到大肠杆菌 BL21 中,经 IPTG 诱导,将获得的重组蛋白用 WesternBlot 鉴 定，镍柱纯化并透析除盐.用重组蛋白免疫动物，观察 PspA 抗体对肺炎链球菌感染小鼠的保护作用.结果：DNA 序列与 GenBank 中的数据相符，所表达纯化的蛋白经 WesternBlot 证实为 PspA，其抗体在肺炎链球菌感染中对小鼠有保护作 用.结论：重组 PspA 刺激产生的抗体能够有效抵抗肺炎链 球菌 TIGR4 侵袭性感染，该重组蛋白可作为肺炎链球菌多 肽联合疫苗的组成部分之一. 【关键词】肺炎链球菌 0 引言 肺炎链球菌是引起肺炎、脑膜炎和中耳炎的主要病原 菌，疫苗侯选蛋白主要集中在其表面的毒力因子如肺炎链 球菌表面蛋白 A（PspA）和胆碱结合蛋白 A（CbpA）等1- 2.PspA 是最早确定的肺炎链球菌毒力因子之一，它可以 与乳铁蛋白结合而使乳铁蛋白丧失功能并抑制补体活化， 降低 C3b 在肺炎链球菌表面的沉淀从而干扰补体介导的调 理吞噬作用，在肺炎链球菌引起的侵袭性感染中起着重要 作用3-4.我们用基因重组技术表达纯化肺炎链球菌毒 力因子蛋白 PspA，并探讨其刺激产生的抗体对肺炎链球菌 侵袭性感染的抵抗作用. 1 材料和方法 材料血清 4 型肺炎链球菌 TIGR4 购自美国国家菌种保 藏中心（ATCC）.大肠杆菌 DH5，BL21，质粒 PET32 为 本室保存.质粒 PMD18T 载体、限制性内切酶 EcoRI，KpnI，PrimeStarDNA 聚合酶和 T4DNA 连接酶购自 Takara（大连）公司.DNA 提取试剂盒为上海华舜公司产品. IPTG，DAB，丙烯酰胺，双丙烯酰胺，完全弗氏佐剂和不完 全弗氏佐剂购于 Sigma 公司.HisTagMcAb，HisBindColumn 柱及 HRP 标记羊抗鼠 IgG 为 Novagen 公司产品.Balb/c 小鼠， 雌性，68 周龄，质量 1820g，购于重庆医科大学实验动 物中心. 方法 PspA 表达载体的构建将肺炎链球菌 TIGR4 在 CY 培养 基中增菌到对数生长中后期，提取基因组 DNA，以之为模板 扩增 PspA 片段.上游引物： 5GGGGTACCATGATTTTAACAAGTCTAGCCAG3，含 KpnI 位点；下游引物： 5CGGAATTCTTATTCTTCTTCATCTCCATC3，含 EcoRI 位 点，由上海生工生物技术公司合成.胶回收 PCR 产物并与 PMD18T 克隆载体连接，转化感受态细胞 DH5，蓝白筛 选，PCR、酶切及测序鉴定.将测序正确的克隆载体和 PET32 表达载体分别用 EcoRI，KpnI 双酶切，胶回收目的 片段，T4DNA 连接酶连接，转化感受态细胞 DH5，双酶切 及 PCR 鉴定.重组质粒转化感受态表达菌株 BL21，于氨苄青 霉素平板上筛选. PspA 重组载体的诱导表达将阳性克隆过夜培养，按 120 接种至含氨苄青霉素的 LB 培养液中，37， 250r/min 振摇培养，A600nm=时加 IPTG（终浓度为 1mmol/L）诱导，37振摇 14h，离心收集诱导菌， SDSPAGE 分析目的蛋白表达情况. 表达产物的纯化及鉴定低温离心收获诱导菌，冰上超 声破菌，12000g 低温离心 1h，收集上清液，同时以相同体 积的超声破碎缓冲液重悬沉淀，行 SDSPAGE 以明确蛋白 是在上清液还是在包涵体.将上清液用 m 滤膜过滤后转入 镍层析柱内，用含不同浓度咪唑的缓冲液梯度洗脱，测定 各洗脱管的 A280nm，SDSPAGE 监测各阶段目的蛋白情况. 收集洗脱蛋白并以 PBS 透析除盐，Bradford 法蛋白定量， 冷冻真空干燥，-20保存. 取诱导的全菌裂解物，经 SDSPAGE 后用电转仪转膜， 以 HisTagMcAb（11000 稀释）为一抗，羊抗鼠 HRPIgG（13000 稀释）为二抗，DAB 为显色底物做 WesternBlot 检测. 免疫动物将小鼠随机分为 2 组，每组 12 只.腹腔免疫 小鼠，实验组方案为：基础免疫：PspA10g只 CFA，加强免疫：每隔 2wk 加强 1 次，连续加强 2 次；对 照组只注射佐剂，免疫方案同实验组.第 3 次免疫 1wk 后眼 眶取血行 ELISA 检测免疫效果，用重组的 PspA 融合蛋白包 被酶标板，加小鼠血清，再加入羊抗鼠 HRPIgG，显色后 读取各孔 A450nm，以高于阴性对照组倍为阳性. 免疫保护实验主动：肺炎链球菌 TIGR4 在 CY 培养基 中增菌到对数生长中后期，于第 3 次免疫 2wk 后腹腔注射 感染上述实验组和对照组小鼠（2106cfu/只） ，连续监测 21d，记录小鼠的生存时间.被动：含 PspA 抗体小鼠血清 100L 腹腔注射小鼠，对照组注射无菌 PBS，被动免疫 24h 后，每只老鼠腹腔注射 2106cfu 的 TIGR4，连续监测 21d，记录小鼠的生存时间. 2 结果 表达载体的构建 PCR 产物经电泳后在 1300bp 附近出现 清晰的扩增条带.扩增产物克隆于 PMD18T 载体，质粒抽 提后，PCR 结果显示有目的基因插入，双酶切出现期望目的 条带（图 1） ，测序结果也与 GenBank 公布的序列一致，证 明 PspA 编码序列正确克隆入 PET32 载体. 图 1 重组表达载体的双酶切鉴定 略 融合蛋白的诱导表达与纯化转化菌诱导后与未诱导菌 相比有一条明显增粗的蛋白条带（图 2） ，其 Mr70000 左右， 与期望值相符合（PspA 蛋白约为 Mr50000，再加上 Mr 为 20000 左右的硫氧还原蛋白）.该目的蛋白主要以上清形式 存在.镍离子柱亲和层析后，透析除去咪唑，SDSPAGE 证 明纯化产物为单一蛋白，目的蛋白已达到相当纯度，凝胶 扫描显示纯度达 90%（图 3）. 图 2图 3 略 表达产物的鉴定诱导的全菌裂解物经 WesternBlot 检 测，于 Mr70000 左右处出现一条深棕色带（一抗 HisTagMcAb，图 4） ，表明目的蛋白带有组氨酸接头.确证获 得了带有 6 个组氨酸接头的融合蛋白. 图 4 全菌裂解物 WesternBlot 分析 略 重组蛋白免疫小鼠后血清对 PspA 蛋白的识别 ELISA 结 果显示，与对照组相比，实验组小鼠产生了高滴度的抗重 组蛋白抗体，滴度可达 18000. 免疫保护用致死量 TIGR4 攻击后，对照组小鼠在 3d 之 内全部死亡，生存时间中位数约为 d；而注射过重组蛋白 PspA 的实验组小鼠在 25d 每日有 12 只死亡，有 3 只存活 至实验结束，生存时间中位数约为 4d.用含 PspA 抗体的小 鼠血清被动免疫小鼠后，用致死量的 TIGR4 感染，对照组 小鼠在 3d 之内全部死亡，生存时