id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌hepg2细胞中的活性检测(1)

Id1Id1 启动子的荧光素酶报告基因载体的启动子的荧光素酶报告基因载体的 构建及其在肝癌构建及其在肝癌 HepG2HepG2 细胞中的活性检细胞中的活性检 测测(1)(1) 作者：丁睿，韩霜，雷婷，刘杰，窦科峰 【摘要】目的：扩增 Id1 启动子基因，构建 Id1 启动 子的报告基因载体.方法：通过 PCR 及双酶切方法，从 HepG2 细胞基因组 DNA 中获得 Id1 基因编码序列上游包含不 同长度碱基的两段 Id1 启动子序列；分别克隆到报告基因 pGL3enhancer 载体上，构建包含两段不同长度 Id1 启动 子的报告基因载体；用脂质体转染法将两报告基因载体分 别转染至肝癌 HepG2 细胞系；采用双荧光素酶报告基因系 统评估 Id1 启动子活性.结果：经 PCR 方法扩增出大小分别 为 1096bp 和 266bp 的两段不同长度的 Id1 启动子片段，序 列测定其编码序列及读框正确，酶切鉴定亚克隆序列正确. 瞬时转染 HepG2 后经报告基因检测，两段启动子均具有转 录活性.结论：成功构建了 Id1 启动子的报告基因载体，为 进一步研究 Id1 启动子和肝癌的关系奠定了实验基础. 【关键词】分化抑制因子 0 引言 Id 蛋白即分化抑制或 DNA 结合抑制蛋白 （InhibitorofDifferentiationand/orDNAbindingprotein s）是缺少 DNA 结合结构域的螺旋环螺旋 （helixloophelix，HLH）蛋白，是 HLH 转录因子的显 性负性调节分子.已知哺乳动物 Id 蛋白家族有 Id1Id4 等 4 位成员.它们可调节多种细胞进程，包括细胞生长、衰老、 分化、凋亡和血管生成等1.研究2表明 Id 蛋白特 别是 Id1，可通过灭活肿瘤抑制因子和激活生长促进通路而 促进哺乳动物细胞的增殖和细胞周期的进行，其可能是肿 瘤增殖所必需的关键因子.Id1 可能是预测慢性肝炎肝硬化 患者的肝癌发生风险的有用指标，并且可作为治疗肝癌的 靶向分子.我们拟构建两段包含不同长度 Id1 启动子片段的 报告基因载体，转染 HepG2 细胞后检测两段 Id1 启动子的 活性. 1 材料和方法 材料 pGL3enhancer 载体，内参照 pRLTK 载体和 DualluciferasereporterKit（Promega 公司） ； LipofectaminTMReagent 和 T4DNA 连接酶（Invitrogen 公 司） ；细胞基因组 DNA 提取试剂盒（Ugene 公司） ；高保真 TaqDNA 聚合酶（上海生物工程公司） ；PlasmidMiniprepKit 和 GelExtrationKit（Omega 公司） ； DNAmarker:GeneRulerTM100bpDNAladderPlus 和 GeneRulerTM1KbDNAladder（MBI 公司） ；胰蛋白胨及酵母提 取物（宝泰克公司） ；限制性内切酶 Hind，Kpn（大连 宝生物工程公司） ；其余试剂均为国产分析纯.TD20/20 荧光 照度计（TurnerBioSystems 公司） ；HepG2 细胞和 JM109 菌 株均为本实验室保存. 方法 启动子报告基因载体的构建 引物设计自 http:/网站数据库检索获得 Id1（GenBank/EMBL 提取号码：NM002165）启动子序列 的-3000100 部分序列，分别设计两段启动子引物序列， 并在上游引物 5端加入 Kpn的酶切位点 GGTACC，在下游 引物 5端加入 Hind的酶切位点 AAGCTT.从转录起始零点 开始，两段启动子片段长度分别为: 101976（1096bp）和18976.上游引物分别为 Fw1：gggtaccgggagcacgggaactagc 和 Fw2：gggtaccccacccttgctgttctga；下游引物 Rv：aagcttggagaatgggcaaagcgaaa. 细胞培养及模板提取将 HepG2 细胞用含 100mL/L 胎牛 血清的 RPMI1640 培养基在 37，50mL/LCO2 的孵箱中培养.收 集对数生长期细胞约 1107，以细胞基因组 DNA 提取试剂 盒提取基因组 DNA. 启动子基因的克隆以 HepG2 细胞基因组 DNA 为模板， 用 Fw1 为上游引物、Rv 为下游引物，经预实验选择 94变 性 1min，55退火 1min，72延伸 1min,共 30 个循环，获 得一长度为 1096bp 的片段，命名为 Id1p1；选用 Fw2 为上 游引物、Rv 为下游引物，经预实验选择 94变性 30s，54退火 30s，72延伸 45s,共 30 个循环，获得一 长度为 266bp 的片段，命名为 Id1p2.用 10g/L 琼脂糖凝胶 进行电泳获得 2 条鉴定条带，大小分别约为 1100bp 和 260bp.参照试剂盒的操作说明回收并纯化. 启动子载体的构建与测序将荧光素酶报告基因 pGL3enhancer 载体分别行 Kpn和 Hind双酶切，回收. 同时将之前回收的 PCR 产物同样经 Kpn和 Hind双酶切 及琼脂糖凝胶电泳，分别回收约 1100bp 和 260bp 条带.使 之分别在 T4 连接酶的作下与 pGL3enhancer 载体以 31 和 101 的浓度比于 16连接 12h，使 Id1p1 和 Id1p2 基 因序列插入无启动子的 pGL3enhancer 载体中.以低温 CaCl2 法转化感受态细菌，涂布于含氨苄青霉素 （100mg/L）的固体 LB 培养皿上，12h 后挑取单克隆菌落， 以质粒小量提取试剂盒提取质粒.行 Kpn和 Hind双酶切 并测序鉴定阳性克隆的重组质粒.最终构建成重组报告基因 载体 Id1p1/PGL3 和 Id1p2/PGL3. 启动子载体转染肝癌 HepG2 细胞系将两种重组质粒、 空载体 pGL3enhancer 和内参照 pRLTK 载体转化的阳性 菌株，在 LB 培养基中 37摇床培养过夜，按质粒提取说明 分别提取 Id1p1/pGL3，Id1p2/pGL3、空载体 pGL3enhancer 和 pRLTK 的 DNA，经紫外分光光度仪测 定 A260nm 值.按照 LipofectaminTMReagent 脂质体转染系 统说明，于转染前 1 日将细胞接种于 24 空板，5104/孔， 第 2 日当细胞约 90%融合时，每孔分别定量加入 Id1p1/pGL3g，PRLTK 内参照载体 100ng，LipofectaminTM5L 和无血清培养基 200L.6h 后 换含 FBS100mL/L 的 RPMI1640，培养 18h. 报告基因活性的检测瞬时转染 24h 后收集、裂解细胞， 离心取上清，用 DualLuciferaseReporterAssaySystem 在 TD20/20 荧光照度计上测定裂解上清内 Luc 活性,计算 FireflyLuc/RenillaLuc 的比值，并以空载体 pGL3enhancer 转染细胞作对照，进行比较以判断 Id1p1 和 Id1p2 启动子活性. 2 结果 目的基因的克隆及测序以肝癌细胞 HepG2 基因组 DNA 为模板，分别克隆出两段 Id1 启动子，分别为 1096bp 的 Id1p1 和 266bp 的 Id1p2（图 1）. 图 1PCR 产物琼脂糖凝胶电泳 略 启动子报告基因载体酶切及测序鉴定回收经 Kpn和 Hind双酶切得到的 Id1p1 和 Id1p2 两重组质粒和 pGL3enhancer 载体的相应条带，经 T4 连接