尹昌林shh 信号通路对脑胶质瘤干细胞增 殖与分化调控作用的实验研究课件

SHH 信号通路对脑胶质瘤干细胞增 殖与分化调控作用的实验研究 第三军医大学附属新桥医院神经外科 杨辉 尹昌林 吕胜青 中国重庆，400037 Fig 1 HH 信号通路的组成和信号传递过程 A、HH 信号通路的组成和信号传递过程，B、HH 信号对GLI 的调控 一、材料和方法 1.严重联合免疫缺陷小鼠（SCID mouse）4 5周龄，雄性，1015g。 2.总共收集31例新鲜人脑胶质瘤组织标本， 按世界卫生组织（WHO）确立的原则进行病理 分型和分级；3例正常对照脑组织标本来源于新 桥医院神经外科同期癫痫手术病人。 3.U251胶质瘤细胞株,CHG-5胶质瘤细胞株 。 1、 人脑胶质瘤组织和细胞株中脑胶质瘤干 细胞 的分离和体外培养，参照Singh等的方 法，采用人CD133细胞分选试剂盒，以免疫 磁珠法进行。 2、体外培养活细胞数测定， 采用CCK- 8试剂盒，以WST-8法进行。 3、 BGSCs增殖与分化过程中 SHH 信号通 路基因表达的检测 ：采用RT-PCR法检测； 4、BGSCs增殖与分化过程中 SHH 信号 通路蛋白表达的检测 ：采用 Western Blotting和免疫荧光技术检测； 5、细胞周期测定：细胞收集、固定后以 PI染色，流式细胞术检测分析； 6、细胞比例测定：细胞收集、固定后行 免疫荧光单标染色，流式细胞术检测分 析。 CD133+细胞从原标本中的1.8%29.7%提高到 46.8%88.7%，而相应的CD133-细胞群标本中 CD133+细胞比例降至1%以下。 图1-1 免疫磁珠法 分选前胶质瘤总体 及分选后CD133+和 CD133-细胞群中 CD133+细胞的含量 上排：P1（A 分选前 ，B CD133+细胞群， C CD133-细胞群） 下排：U251（a 分选 前，b CD133+细胞群 ，c CD133-细胞群） ABC abc 人脑胶质瘤干细胞生长情况 照片2 肿瘤球经有血清培养基诱导分化4 h 7 d，肿瘤球首先贴壁并伸出 突起（A-4 h），细胞逐步迁移出来呈放射状分布并分化，表型与亲本肿 瘤一致（B、C-3 d，D-5 d，E-7 d，F-亲本肿瘤P1例，200） A BC D E F 照片3 胶质瘤干细 胞形成的肿瘤球均 表达干细胞标志物 Nestin（A）和 CD133（B），以 Hoechst 33342（C ）显示细胞核，经 重合检查（D）多 数细胞同时表达 Nestin和CD133， 但细胞表达Nestin 的强度高于CD133 ，表达Nestin的细 胞数量多于表达 CD133的细胞（ 400） AB C D 照片4 胶质瘤干细胞与CD133-胶质瘤细胞超微结构，胶质瘤干细胞和间 比较大，突起少，胞浆中细胞器较少，核糖体丰富，为见胶质丝等分化 结构，符合干细胞超微结构特点（A 20000，C 4000）；CD133-胶 质瘤细胞可见较长突起，胞浆内线粒体、粗面内质网等细胞器丰富，属 于典型分化细胞的超微结构（B 17000，D 4000） ABCD 照片5肿瘤球经有血清培养基诱导分化3 d、7 d，产生GFAP、MAP2、 MBP、CD133染色阳性的肿瘤细胞，上排-分化3d（A-GFAP、B-MAP2、 C-MBP、D-CD133），下排-分化7 d（E-GFAP、F-MAP2、G-MBP、H- CD133），4种细胞在3 d和7 d所占比例不同（亲本肿瘤P1例，400） ABCD E FGH 照片7 P1和P1移植SCID鼠后8 w成瘤情况：A、SCID鼠，B、处死动物 后右侧腋部皮下检视发现成瘤（红色箭头所示），C、移植瘤大小及所对 应的移植细胞类型和数量，D、亲本肿瘤呈GFAP阳性染色（400），E、 亲本肿瘤HE染色（400），F、移植瘤HE染色（400） ABC DEF 500 bp 250 bp 500 bp 1 2 3 4 图2-1 脑胶质瘤干细 胞中SHH信号 通路基因表达 情况(P1) 上图：脑胶质瘤干细胞中 SHH信号通路基因 的表达 1.Marker， 2.SHH(233 bp)， 3.GLI-1(292 bp)，4.BMI-1 (312 bp) 下图：内参 GAPDH ( 579bp) 250bp 500bp 10986512347 500bp 250bp 500bp 109865347 图2-2-1 脑胶质瘤干细胞诱导分化过程中SHH 信号通路基因表达变化(U251) 上图：脑胶质瘤干细胞诱导分化过程中SHH信号通路基因的表达 1. Marker，2. SHH(233 bp，0d)，3. GLI-1(292 bp，0d)，4. BMI-1(312 bp，0d)，5. SHH(3d)，6. GLI-1(3d)，7. BMI-1(3d)，8. SHH(7d)，9. GLI-1(7d)，10. BMI-1(7d)； 下图：内参(GAPDH 579bp，时相点同上图) AB CD EF GH Fig. 14 Gli-1 protein expressed in BGSCs(stained with CD133)(P1，400) Left: Gli-1 protein seems to express in BGSCs under normal exposure. Right: Weak expression of Gli-1 protein in BGSCs was detected under longer time and more intensity of exposure A.E-CD133 staining，B.F-Gli-1 staining，C.G-Hoechst 33342 counterstaining，D.AC merge，H.EG merge Fig. 15 Bmi-1 protein expressed in BGSCs (P1) A.Bmi-1 staining B.CD133 staining C.Hoechst 33342 counterstaining D.AC merge AB C D 脑胶质瘤干细胞分化过程中 SHH 信号通路蛋白表达情况 1.Western Blotting在分化第3 d可检测到 明显的Shh和Gli-1的表达 ; 2.分化第3 d，CD133、MAP2、GFAP和MBP 染色阳性的细胞均可较强地表达Gli-1；分 化第7 d时4类细胞表达Gli-1明显减弱，部 分细胞不表达Gli-1。 12 345678 42kD 150kD 27kD Shh Gli-1 -actin 图2-3 脑胶质瘤干细胞诱导分化0、3d时Shh、Gli-1 的表达 上、中图：各标本表达Shh、Gli-1的情况 0d(14)：1 U251，2 CHG-5，3 P1，4 P2； 3d(58)：5 U251，6 CHG-5，7 P1，8 P2； 下图：内参(-actin,时相点同上图) Fig. 16-1 Gli-1 protein expressed at the 3rd day after BGSCs differentiating (400) Left: MAP2/Gli-1 positive cells (AD)： A.MAP2, B.Gli-1, C.Hoechst 33342, D.AC merge Right: GFAP/Gli-1 positive cells (EH)：E.GFAP, F.Gli-1, G.Hoechst 33342, H.EG merge A B CD FE G H 图2-9-1 经RNAi-SHH 后脑胶质瘤干细胞诱导分化0、3d 时SHH信号通路基因表达的变化（P1） 上图：未干扰组及内参；中图：干扰组及内参；下图：阴性对照组及内参。 1 Marker，2 SHH（233 bp，0d），3 GLI-1（292 bp，0d），4 BMI-1（312 bp，0d）， 5 SHH（3d），6 GLI-1（3d），7 BMI-1（3d），内参（GAPDH 579bp，时相点同上图） 250bp 500bp 250bp 500bp 500bp 1234567 500bp 500bp 250bp 500bp 27kD 42kD 12345678 Shh -actin 图2-10-1 脑胶质瘤干细胞诱导分化0、3d时Shh 的表达变化 上图：各标本表达Shh的情况 14 0d：1. U251，2. CHG-5，3. P1，4. P2； 58 3d：5. U251，6. CHG-5，7. P1，8 .P2； 下图：内参(-actin,时相点同上图) 42kD 150kD 12345678 Gli-1 -actin 图2-11-1 脑胶质瘤干细胞诱导分化0、3d时Gli-1 的表达变化 上图：各标本表达Gli-1的情况 14 0d：1 U251，2 CHG-5，3 P1，4 P2； 58 3d：5 U251，6 CHG-5，7 P1，8 P2； 下图：内参(-actin,时相点同上图) SHH 信号通路对中枢神经系统的 发育是必需的。 在体实验：虽然GLI-1基因敲除的 小鼠能正常发育，但SHH、Ptch、GLI-2 或GLI-3基因敲除的小鼠均在出生前即死 亡，并伴有脑部的严重缺陷。 在本课题研究中我们发现：在脑胶质 瘤组织和细胞株中均检测到SHH 信号通路 关键分子Shh、Gli-1和Bmi-1表达，而正常 成人脑组织中则未检测到；对其表达情况 进行分析表明，Shh和Gli-1表达与胶质瘤 病理分级有关，高级别胶质瘤组织中表达 强于低级别胶质瘤组织中表达。 胶质瘤干细胞分化时，Gli-1表达呈逐 渐增强，然后逐渐减弱至消失的过程， CD133表达逐渐减弱，MAP2、GF