蛋白印迹_ppt课件

Western blot 实验技术 （免疫印迹实验） 【基本原理】 nWB的过程包括蛋白质经凝胶电泳分离后，在电 场作用下将凝胶上的蛋白质条带转移到硝酸纤 维素膜上，经封闭后再用抗待检蛋白质的抗体 作为探针与之结合，经洗涤后，再将滤膜与二 级试剂-放射性标记或HRP或AP偶联抗体结合， 进一步洗涤后，通过放射自显影或酶反应来确 定抗原-抗体-抗抗体复合物在滤膜上的位置和 丰度。 Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western Blot一般流程 n蛋白样品的制备 nSDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 l转膜 l封闭 l一抗杂交 l二抗杂交 l底物显色 【器材】 n转移电泳仪 ，硝酸纤维素膜，滤纸，剪刀， 手套 凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶浓度（）线性分离范围（kDa) 1512-43 1016-68 7.536-94 5.057-212 制胶 n12%分离胶(15ml) 双蒸水 4.8ml 30% Arc/Bis 6ml 分离胶缓冲液 (pH8.8) 4ml 10% SDS 150ul 10%APS 75ul TEMED 8ul 灌胶，待凝，约1小时 n4%浓缩胶（7.5ml） 双蒸水 4.55ml 30% Arc/Bis 1ml 分离胶缓冲液 (pH6.8) 1.9ml 10% SDS 75ul 10%AP 75ul TEMED 7.5ul 灌胶，插梳子，待凝，约0.5小时 v准备样本 加2Loading Buffer,混匀，煮沸35分钟， 10000g离心10分钟 取上清适量上样 v电泳：5mA/胶 大约需时2小时 二、转移印迹 1转移前准备：将滤纸，硝酸纤维素膜（NC）剪成与 胶同样大小，NC膜浸入转移buffer中平衡30min。 2凝胶平衡：将电泳后的SDS-PAGE胶板置于转移 buffer中平衡30-60min。 3按图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折 。 4开始转移，连接正负极，盖好盖子，接上电源，恒 流380mA，冰浴转移30min。 取出一块胶做考马斯亮兰染色 另一块胶转膜 转膜：负极到正极，依次放海绵，滤纸，凝胶， 硝酸纤维膜， 滤纸，海绵 380mA 30分钟 三、免疫染色 1转移后的NC膜于5%脱脂奶粉中封闭，4过夜。 2TBS洗膜1-2次，10min/次。 3. 加一抗孵育，37 或室温孵育1h。 4. TBS洗3次，10min/次。 5加HRP标记的抗体，室温1h 。 6TBS洗3次，10min/次。 7NC膜再转入DAB显色液中，避光反应，待显色反应达 到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应 转膜 膜的选择膜的选择 尼龙膜尼龙膜 硝酸纤硝酸纤 维素膜维素膜 封闭非特异性抗体结合麻烦封闭非特异性抗体结合麻烦 简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合 价格昂贵价格昂贵 价格便宜价格便宜 特殊要求下的选择特殊要求下的选择 需要更高的蛋白结合率需要更高的蛋白结合率 （尼龙膜：（尼龙膜： 480g/cm480g/cm 2 2 ；硝酸纤维素膜：；硝酸纤维素膜：80g/cm80g/cm 2 2 ） 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱 需要更大的机械强度需要更大的机械强度 转膜 半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间，电转1030min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 置的缓冲液中，电转45min或过夜。 转膜后检测 n丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤 膜，换水几次。 n印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的 Western印迹过程。 封闭 n脱脂奶粉（5） nBSA nWestern Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 一抗、二抗孵育 n把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入一抗溶液与膜 温育。37 1h或4过夜。 n倒掉一抗溶液，洗膜3次， 10min/次。 n加入二抗，摇床缓慢摇动， 37 1h或4过夜。 n倒掉二抗溶液，洗膜3次， 10min/次。 nNC膜再转入DAB显色液中，置暗处反应，待显色反应达到最 佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应。 二抗与底物反应显色二抗与底物反应显色 辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法 1 2 3 4 M Mr 1 2 3 4 Fig 1.SDS-PAGE and Western blot analysis for the CT-MOMP multi-epitopes protein 朱珊丽老师的结果 Western Blot常见问题分析 SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的 作用？ n聚丙烯酰胺：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载 体； n制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择 pH8.9，选择TrisHCl系统； nTEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的 凝固； n十二烷基硫酸钠（SDS）：去蛋白质电荷、解 离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水 作用、去多肽折叠。 SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳 u 胶不平？ u 凝胶漏液？ 胶板洗刷干净 加入APS和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混 合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶 聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐 u条带比正常的窄？ u“微笑”或“倒微笑”条 带？ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合 均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心， 以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致 宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应 赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否 合适 转膜及抗体检测 u凝胶肿胀或卷曲？ u条带歪斜或漂移？ u单个或多个白点？ u转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液 中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三 明治”结构不紧凑导致。可在两块海 绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压 太高。转膜过程注意降温 背景太高 1.膜没有均匀浸湿 2.