血细胞分析仪原理课件

第三章 血液分析仪检查 目的要求 l 1、掌握：血液分析仪各项参数的缩写、参考 值、直方图概念。 l 2、熟悉：血液分析仪电临床应用、检测参数 、方法学平价、血细胞直方图正常形态特点 及常见异常形态、临床应用。 l 3、了解：血液分析仪的进展。 l重点 : 1、血液分析仪测定的原理、方 法 2、血液分析仪各参数临床意义 l难点: 血液分析仪检验的质控 1 血液分析仪的发展史 自动血液分析仪（automated hematology analyzer, AHA)，早年称血细胞计数仪（ blood cell counter)，是目前国内外临床检验最 常用的筛检仪器之一。 1、传统采用手工方法 2、20世纪50年代，美国的Coulter设计了第一台 电子血细胞计数仪。还产生了血红蛋白仪。 3、20世纪70年代 检测血小板的仪器Baker- 810 4、20世纪80年代，可打印WBC、RBC、 PLT体积分布直方图。 5、20世纪90年代，白细胞分类的开发（二分 类、三分类）；将网织红细胞检测技术用于 血细胞分析仪；生产了血液学全自动系统。 6、现在，白细胞五分类，仪器组合化 血细胞分析仪近年来的发展变化 1. 血常规检验多参数化 2. 多功能合成扩展 3. 检测速度的提高 4. 方法的改进和进展 5. 应用的方便性 血液分析仪功能： 全血细胞计数 功能。 白细胞分类功能 。扩展功能。 血液分析仪优势 检测项目多 速度快 精度高 易操作 2 检测原理 检测原理 电学 光学 电阻抗法 射频电导法 激光散射法 分光光度法 一、电阻抗法 血细胞计数原理即库尔特原理（ Coulter principle):根据血细胞非传导的 性质，以电解质溶液中悬浮的血细胞在 通过计数小孔时引起的电阻变化进行检 测为基础，进行血细胞计数和体积测定 。 l小孔管是电阻抗法细胞计数的一个重要组 成部分。检测期间，当电流接通后，位于 小孔两侧的电极产生稳定的电流。如果供 给的阻抗也是稳定的，则小孔的电压是不 变的。 l当有一个细胞通过小孔时，由于电阻增 加，于瞬间引起电压变化通过脉冲 。 l细胞体积越大，脉冲振幅越高；细胞数 量越多，脉冲数量也越多。 l脉冲信号经过下列步骤，得出细胞计数 结果： l放大 由于血细胞通过微孔时产生的脉冲 信号微弱，必须通过放大器将讯号放大 。 2. 阈值调节 在一定范围内调节参考电平的 大小，使计数结果尽可能符合实际。 3. 甄别 利用甄别器根据阈值调节器提供的 参考电平，将低于参考电平的假讯号（ 细胞碎片，杂质微粒）去掉。 4. 整形 通过整形器作用，将脉冲讯号波形 修整成一致标准的平顶波，才能触发电 路 5 计数 血细胞的脉冲信号，经过放大、甄 别、整形后，送入计数系统，得出计数 结果。 电阻抗法可准确测量出细胞（或类似颗 粒）的大小，是三分群血液分析仪的主 要应用原理，并与光学检测原理组合应 用于五分类血液分析仪中。 三分群血液分析仪基本组成 信号发生器各种微粒通过检测小孔产 生电阻抗脉冲信号的检测源。 放大器将血细胞微弱脉冲信号放大以 触发电路系统。 阈值调节器调节能区分不同群细胞合适的 信号电平。 甄别器去除非参考电平的各种假信 号以提高计数的准确性。 整形器将不一致的脉冲波形信号调 整为标准的波形后触发计数电路系统。 计数系统 将整形后的血细胞脉冲信号 显示为不同类群的细胞数。 二、激光散射法 激光散射法应用了流式细胞术(flow cytometry, FCM) 检测原理。 流式细胞术检测原理：细胞通过激光束被照 射时，产生与细胞特征相应的各种角度的 散射光。对经信号检测器接收的散射光信 息进行综合分析，即可准确区分正常类型 的细胞。 半导体激光的流式细胞术 侧向荧光（ RNA/DNA含量） 激光 （波长633nm） 侧向散射 （细胞内部结构，如 核的大小） 前向散射光 （细胞大小） 低角度散射光（前向散射光）：反映细胞 的数量和表面体积大小。 高角度散射光（侧向散射光）：反映细胞 的内部颗粒、细胞核等复杂性。 l激光散射法在区别体积相同而类型不同 的细胞特征时，比电阻抗法分群更加准 确。故激光散射法已成为现代五分类血 液分析仪的主要检测原理之一。 流式细胞仪的技术特点 流式细胞仪在设计上采用了许多独特的技 术，比如液流系统、光路系统、信号测量 和细胞分选方面都有自己的技术特点。着 重讲述液流系统鞘流原理。 雷诺系数 Re Red / d: 管子的直径 ：液体的密度 ：液体的流速 ：液体的粘滞系数 Re2300， 液流处处于湍流状态态 通常把标本流的流速控制在10m/s以内， 就能保持标本流处于稳流状态。 外面包被有高速流动的鞘液，实现标本与 鞘液稳定的同轴流动状态。 同时利用液流聚焦原理，使标本流直径变 小，通常只有1020m，避免细胞多 个重叠进入检测区。 激光散射法系统基本组成 1、光源 气体（氦氖）激光或固体（半导 体）激光（单色光）；钨光源（多色光） 。 2、鞘流 维持颗粒于液流中央，顺序、单个 、恒速向前流动，即流体动力学聚焦。 3、细胞悬液 被检测细胞（颗粒）的悬 液，由气压导入流动池。 4、光检测器 接受来自各种角度的散射 光或吸收光信号，并转换成相应特征的 电信号 三、射频电导法 l 射频（radio frequency, RF) 指射频电流， 是每秒变化大于10 000次的高频交流电磁波 。高频电流能通过细胞壁。 l 用高频电磁探针渗入细胞膜脂质可测定细 胞的导电性，提供细胞内部化学成分、细 胞核和细胞质、颗粒成分等特征信息。 四、分光光度法 Lambert-Beer定律：A=lg(I0 / I) A:吸光度，或称光密度；I0：单色入射光强度 ； I ：透过光强度 分光光度法仪器的组成：单色光源、检测池 和比色容器、光检测器。 l分光光度法是所有类型的血细胞分析仪检 测Hb 的原理：被稀释的血液加入溶血剂 后，红细胞溶解，释放血红蛋白，后者与 溶血剂结合形成Hb衍生物，在特定波长（ 530550nm）下比色，吸光度的变化与液 体中Hb含量成比例。 血红蛋白 血红蛋白 衍生物 吸光度 Hb浓度 溶血剂 540nm 血红蛋白测定的溶血剂 溶血剂 含氰化物的溶血剂 不含氰化物的溶血剂 3 血液分析仪检测参数 原理 不同类型血液分析仪检测参数的原理不 尽相同。高档仪器应用2种或2种以上检 测原理，组合电学、光学、细胞化学等 技术，在独特检测通道测定红细胞、血 小板和白细胞系列的数量、亚类及相关 参数。 一、白细胞系列参数检测原理 l仪器将体积为35450fL的血细胞，分 为256个通道（channel）。每个通道： 1.64fl。根据细胞大小，分别置于不同 的通道中，显示血细胞体积分布直方图 (Histogram)。 （一）电阻抗法 1.分群 l 经溶血素处理脱水后，血细胞体积大小发生了变 化！ l 第一群（3590fl）小细胞区：淋巴细胞（体积 最小）。 l 第二群（90160fl）单个核细胞区，（中间细胞 ）：单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、 原始、幼稚细胞、异常细胞等。 l 第三群（160fl以上）大细胞区：嗜中性粒细胞（ 体积最大）。 2.白细胞分布直方图 三分群血液分析仪 正常白细胞分类模式图（直方图） 35 90 160 300 400 450(fl) % （二）光散射法白细胞分类 l体积、电导和光散射法（volume, conductivity, light scatter, VCS) V C S 电阻抗技术 细胞大小和 内部结构 细胞内的颗粒性、核 分叶性和细胞表面结 构 体积 电导 光散射 2、电阻抗与射频法（能透入细胞内，测量 核的大小及颗粒的多少）。 RF:射频电流 细胞内部结构信息 DC:直流电 细胞大小的信息 （1）嗜酸性粒细胞检测系统 专用的E溶血 剂，电阻抗法 （2）嗜碱性粒细胞检测系统 专用的B溶血剂 ，电阻抗法 （3）淋巴、单核和粒细胞检测系统 电阻抗 和射频联合检测 （4）幼稚细胞检测系统 电阻抗法 成熟 幼稚 成熟 幼稚 膜上脂质少 膜上脂质多 加入溶血剂 结合AA多 结合AA少 加入硫化AA 幼稚 保持完整 细胞破坏 3、多角度偏振光散射法（MAPSS) （1）白细胞计数 用含DNA染料碘化丙啶试 剂可破坏有核红细胞膜和细胞质，只留下细 胞核，裸核易于染色。染料对有活性的白细 胞只有极小渗透性或无渗透性，故不出现细 胞核染色。从而鉴别有核红细胞和活性白细 胞，计算活性白细胞比率。 （2）白细胞分群 MAPSS 0,前向散射光：细胞大小、数量 7，侧向散射光：细胞内部结构及 核染色质的复杂性 90，垂直角度散射光：细胞内 部颗粒及分叶状况 90D，垂直角度去偏振散射 光，鉴别E与N MAPSS法可鉴别白细胞亚群、异常细胞类 型，白细胞分类不受有核红细胞、血小板 凝聚、未溶解红细胞和细胞碎片等干扰物 质影响。 运用这类原理的血细胞分析仪：SF-3000、 CD-3500 、MEK-8118K 、Diana-5和 EXCELLTM-22等。 4、激光与细胞化学技术联合应用 （1）过氧化物酶（Peroxidase, Perox)染色通道 过 氧化物酶活性强度：ENM, L和B则无。 （2）嗜碱性粒细胞/核分叶性（baso/ lobul- arity)通 道: 除B外其他细胞仅剩裸核，不同细胞的裸核结 构不同，分叶越多散点越靠近横轴右侧，根据多 分叶核和单个核的比例，可计算出左移指数。 （3）未染色大细胞计数检测 5. 双鞘流动力连续系统 (DHSS) 用钨光源流式细胞光吸收、化学染色和电阻抗法 WBC计数通道：电阻抗法 嗜碱性粒细胞通道：专用染液 WBC分类通道：双鞘流系统中，用流式细胞光 吸收、电阻抗和细胞化学染色液联合检测除B以 外的WBC。 DHSS技术：在流式通道中有2个鞘流装置 ，细胞经第1束鞘流后通过阻抗微孔测定 细胞的真实体积，然后经第2束鞘流后到 达光窗，测定细胞的光吸收，分析细胞内 部结构。 二、成熟红细胞系列参数检 测原理 1、红细胞数和红细胞比积：原理通WBC计 数 红细胞体积分布直方图 （一）电阻抗法 2 、血红蛋白含量测定 分光光度法 3、 各项红细胞平均指数检测 根据RBC 、 HCT 和HGB换算出来。 4 、红细胞体积分布宽度（ RDW ） 不同 大小的脉冲信号分别贮存在仪器内装计 算机的不同通道，计算出相应的体积及 细胞数，经统计处理得到RDW。 （二）流式细胞术光散射法 1、光散射法红细胞、血红蛋白检测原理 低角度(23)：测量红细胞体积。 高角度(515)：测定红细胞血红蛋 白浓度。 2、红细胞散点图 是红细胞体积与血红 蛋白浓度二维散点图，反映光散射与 细胞体积和血红蛋白浓度之间的相互 关系，能准确区分小红细胞等异常。 线性体积/血红蛋白浓度（V/HC)散点 图分为9个区。 三、血小板系列参数检测原理 （一）电阻抗法 血小板计数（platelet, PLT）： 随红细胞在一个系统中进行检测。 直方图在228fl（不同仪器不一）。 % 10 20 30(fl) （二）激光散射法 l 根据Mie同质性球体光散射理论，球形化PLT 通过激光照射区时，在高角度得到PLT折射 指数（refactive index, RI)，与PLT密度有关 （PLT:1.351.40, RBC:含有高浓度Hb，RI 为1.351.44）；低角度得到血小板大小。此 法可区分PLT和红细胞。 （三）流式细胞激光核酸荧光染色和电阻抗 法 红细胞/血小板计数通道电阻抗法结果异 常时，转换至光学法核酸荧光染色网织红 细胞/血小板检测通道。通过核酸荧光染色 鉴别网织Plt、成熟Plt和成熟RBC. （四）固体激光散射法、电阻抗法和单克隆 抗体荧光染色散射法 四、网织红细胞系列参数检 测原理 （一）非荧光染料染色法 用新亚甲蓝对网织红 细胞RNA染色，采用VCS技术测定Ret。此外， 应用柔变轮廓分析技术，以非线性方式区分红 细胞群和成熟红细胞群。 （二） 荧光染料染色法 （1）用聚次甲基染 RNA和恶嗪染DNA法（2）用氧氮杂芑750染 RNA法（3）用非对称菁荧光染料染RNA法。 （4）用噻唑橙染网织红细胞RNA法。 五、有核红细胞系列参数检 测原理 1.VCS法 2.流式激光/荧光染色法 （1）聚次甲基荧 光染色法 （2）碘化丙啶染色法 3.白细胞计数和分类通道衍生法 4. 阻抗法和噻唑橙荧光染色流式细胞术 六、血细胞分析仪工作流程 （电阻抗法） 4 血细胞分析仪的类型 根据对白细胞分析程度分为二分群、三分 群、五分类。 根据自动化程度又分为二大类：半自动仪 器须手工稀释标本；全自动仪器可直接 用抗凝血进样。 一、半自动二分群血细胞 分析仪 检测速度为60个/h,仪器为双通道，容易 操作。 用血量少，准确性、重复性好。 测量结果超过正常界限和直方图不正常 ，可出现警示符号提示。 1.仪器性能 有质控资料及标本检测资料贮存、手工鉴 别、设备警告等软件程序。 对仪器状况可自动监测。 2. 检测项目 可检测815项参数及3个直方图，主要 有WBC, RBC, Hb，PLT, MCV, MCH, MCHC等，并打印出白细胞、红细胞及 血小板直方图。 图1半自动分析仪 这是一个容易操作的 系统。接通电源后，仪器 处于正常的操作待机状态 时，只要把20l 血液样 品在机外稀释，混匀后放 在样品架上，按下计数键 它就可以对15种血液指标 和3个细胞直方图进行一 次分析。测定完成后结果 会立即在LCD上显示并将 结果打印出来。 3. 半自动血细胞分析仪的测试程序 1）机外手工加溶血剂方式 先将标本（末梢血或 抗凝经脉血）用稀释液进行预稀释（稀释倍数 因仪器型号而异),然后按仪器说明书要求将适 量的溶血剂加入已稀释的标本中混匀后上机进 行检测，打印或记录测试结果。这类仪器如F- 820、MEK-5108K。 2） 机内自动加溶血剂方式 先将标本（ 末梢血或抗凝经脉血）用稀释液进行预 稀释（稀释倍数因仪器型号而异),然后 将已稀释的标本混匀后（溶血剂由仪器 自动定量注入） 上机进行检测，打印或 记录测试结果。这类仪器如 AC-920(预 稀释通道）、BC-2000。 二、全自动三分群血细胞分析仪 检测速度为6080个/h, 配上自动装置可 连续吸取样本，避免实验室内感染。 两种溶血素，即白细胞溶血素和红细胞 溶血素SLS-Hb法（无毒） 仪器线性范围宽、重复性好、准确性高 、变异范围小。 1.仪器性能 有的设有浮球式绝对定量装置，携带污染 率几乎为零。 自动化程度高，对试剂污染、气泡干扰、 异物阻塞有监控系统。有自动报警系统。 有质控资料及标本检测资料贮存等软件程 序。 2. 检测项目 除二分群的15项参数外，还增加 了中等大小白细胞比率（W-MCR)、中等 大小白细胞计数（W-MCC)及大血小板比 率（P-LCR)，达18项参数。 3. 代表仪器：CD-1700 、Coulter ONYX血细 胞分析仪等。 三、全自动五分类血细胞分析仪 速度快，每小时110150个标本。 具有检测有核红细胞的功能。 专用幼稚细胞检测通道和试剂。 多种分类技术的使用使白细胞分类更加 精确，达到最低分类镜检率。 1.仪器性能 强大的网络功能及完善的数据管理系统 ，可开展远程诊断，远程维护和质控提 供软件支持。 高效、自动的标本资料管理及强大的工 作平台。 无错进样管理，包括穿刺进样，条码识 别和双重样本完整性探测器。 仪器可与网织红检测仪、自动进样仪、 自动涂片机相联，形成自动化模块。 2. 检测项目 可检测25项参数或更多。有些 仪器可根据需要选择不同检测模式。 3. 代表仪器 SF-3000血细胞分析仪、MEK- 811K+QA-810VK、EXCELTM22血细胞 分析仪等。 四、全自动五分类连接网织红 细胞分析仪 准确性高，通过对细胞RNA检测比目 测法更准确、敏感。 精确度达97以上。并可将网织红细胞 分类为LFR 、MF