残留检测技术进展ppt课件

化学物及 代谢物 分离纯化 监控 兽药等化学物 样品 检测方法 快速检测方法 仪器确证方法 固相萃取技术 基质固相分散技术 免疫亲和色谱技术 分子印迹技术 超临界萃取技术 四、有害化合物残留检测技术 微生物抑制测定法 酶联免疫吸附测定法 量子点标记荧光检测法 荧光偏振免疫检测法 化学发光免疫检测法 放射免疫测定法 金标试纸条 生物传感器 生物芯片 1、快速检测方法 荧荧光偏振免疫分析技术术 荧荧光偏振免疫分析（Fluorescence polarization immunoassay，FPIA）是竞竞争性的均相免疫分析方 法，就是检测荧检测荧 光标记标记 抗原（tracer）在结结合特异 性的抗体前后，荧荧光偏振值值（FP）值值的变变化，不需 要分离结结合的和未结结合的抗体，经过经过 几分钟钟甚至是 几秒钟钟的温育便可直接测测量，很快得到被测药测药 物的 浓浓度，实验实验 的时间仅仅时间仅仅 决定于加样样的时间时间 FPIA 是竞争性的均相免疫分析 抗原浓度低 FP值高 Ag Ag Ag Ab Ab Ag Ag Ag Ab Ab Ag Ag Ag F F Ag F F Ag F F Ag F F 抗原浓度高 FP值小 Ag Ab Ab AgAb Ag F F Ag F F Ab Ag F F Ag F F 荧光素与磺胺二甲基嘧啶偶联 SMSM 2 2 -FITC-FITC TLC分离纯化 F F F F F Y Y Y Y Y Y Y F F Y F Y F F Y 测定荧光偏振值 双抗夹心TR-FIA反应原理示意图 氯霉素 莱克多巴胺 化学发发光免疫分析技术术 化学发光免疫分析（CLIA），一般分 为两种模式。第一种是以发光剂作为酶免 疫测定的底物，通过发光反应增强测定的 敏感性；第二种是以发光剂作为抗体或抗 原的标记物，直接通过发光反应检测标本 中抗原或抗体的含量 Cl-ELISA 与传统ELISA灵敏度比较 Cl-ELISA ELISA Development of a Chemiluminescent ELISA for Determining Chloramphenicol in Chicken Muscle， Journal of Agriculture Food and Chemistry, 2006, 54 (16), 57185722 化学发 光免疫 检测氯 霉素 量子点标记标记 免疫分析技术术 量子点(quantum dots，QDs)又称半导导体纳纳米 微晶体，是一种由II-VI族或-V族元素组组成的，直 径约为约为 1-100nm，能够够接受激发发光产产生荧荧光的半导导 体纳纳米颗颗粒，量子点表面结结构经过经过 修饰饰，借助于其 外端的羧羧基，能与生物分子的氨基相结结合，如抗体 等偶联联 2、仪器分析方法 气相色谱法（GC） 高效液相色谱法（HPLC） 原子荧光法(AF) 原子吸收法(AA) 气谱-质谱法（GC-MS） 气谱-串联质谱法（GC-MS/MS） 液谱-质谱法（LC-MS） 液谱-串联质谱法（LC-MS/MS） 1 pg/g1 ng/g1 g/g1 mg/g 紫外/可见分光光度法 放射免疫测定法/酶免疫测定法 色质联用分析 放射受体分析 气相色谱(ECD/NPD) 气相色谱(FID) 高效液相色谱(FLD/UVD) 极谱法 荧光分光光度法 微生物测定法 比色法 各种测定方法的灵敏度范围各种测定方法的灵敏度范围 有害化合物残留检测检测 ：先用快速 检测产检测产 品进进行筛查筛查 ，可疑阳性 样样品再用仪仪器分析方法尤其是色 质联质联 用检测检测 方法加以确证证。 美国、欧盟、日本等均采用此策略，抽检数 量超过总样品数的10%！ 1、快速检测产检测产 品种类类 试剂盒 试纸条 生物传感器 免疫芯片 快速检测仪 检测箱 目前主要的快速检测产品包括: 五、快速检测产品研制 2、小分子抗体制备备技术术 目前抗体种类类主要是多抗和单单抗 替代抗体：基因重组组抗体、纳纳米抗体、核酸适配体、抗转转 运蛋白、受体、分子印迹聚合物等均有相关研究 核酸适配体抗转运蛋白 兽药分子量大都小于1000， 药物本身没有免疫原性，必须经 过结构改造后与大分子载体蛋白 结合才能产生有效抗体 半抗原 信 息 含 量 丰 富 的 半 抗 原 合 理 设 计 小分子 结构优化 计算化学 性质参数（物化、 电量、空间等信息 ） 最佳半抗原 免疫动物 抗体 合适 抗原 表位 间间 隔隔 臂臂 最佳半抗原 统计分析 l应用量子力学AM1，得到了磺胺类和玉米赤霉醇类 药物的物化、电性、疏水性等性质，从分子水平比 较各药物与半抗原的异同（化学学报，2008，66， 2613-2619）。为半抗原合理设计提供了方法指导 SM2化学结构 SM2最低能量构象 SM2最高占据轨道（ HOMO）和最低未占据 轨道（LUMO） 玉米赤霉醇类药物的三维构象和电荷分布玉米赤霉醇类药物的三维构象和电荷分布 Table 2. Physical and chemical indexes of -zearalanol and analogsTable 2. Physical and chemical indexes of -zearalanol and analogs HaptensHaptens V V S S R R Log PLog P P P H H MWMW D D 18-1418-14 D D 18-1618-16 -zearalanol-zearalanol937.37937.37601.85601.8590.3890.381.161.1634.3134.312.94992.949952.5152.51322.40322.4011.1811.189.379.37 -zearalanol-zearalanol925.51925.51597.57597.5790.3890.381.161.1634.3134.310.99220.992254.1254.12322.40322.409.569.567.997.99 -zearalenol-zearalenol903.64903.64583.54583.5491.5091.500.900.9034.1234.123.20333.203352.6852.68320.39320.397.997.996.476.47 -zearalenol-zearalenol916.33916.33644.55644.5591.5091.500.900.9034.1234.124.2084.20850.3950.39320.39320.399.359.357.217.21 zearalanonezearalanone909.49909.49593.31593.3189.3589.351.371.3733.7633.763.47483.4748113.07113.07320.39320.3910.0510.059.339.33 zearalenonezearalenone905.71905.71603.74603.7490.4790.471.101.1033.5733.575.63085.6308111.13111.13318.37318.378.108.106.446.44 Table 3. Quantum chemical indexes of -zearalanol and analogsTable 3. Quantum chemical indexes of -zearalanol and analogs HaptensHaptens Q Q O1O1 Q Q O3O3 Q Q O14O14 Q Q O16O16 Q Q O18O18 Q Q C11C11 Q Q C12C12 Q Q C17C17 E E HOMOHOMO E E LUMOLUMO E E -zearalanol-zearalanol-0.4326-0.4326-0.4929-0.4929-0.6257-0.6257-0.6153-0.6153-0.6187-0.6187-0.2388-0.2388-0.3347-0.3347-0.4067-0.4067-12.297-12.297-1.706-1.70610.59110.591 -zearalanol-zearalanol-0.4346-0.4346-0.4910-0.4910-0.6262-0.6262-0.6155-0.6155-0.6129-0.6129-0.2374-0.2374-0.3352-0.3352-0.4071-0.4071-11.988-11.988-0.887-0.88711.10111.101 -zearalenol-zearalenol-0.4753-0.4753-0.4830-0.4830-0.6256-0.6256-0.6132-0.6132-0.6588-0.6588-0.0885-0.0885-0.1590-0.1590-0.3931-0.3931-12.252-12.252-2.388-2.3889.8649.864 -zearalenol-zearalenol-0.4275-0.4275-0.4938-0.4938-0.6267-0.6267-0.6147-0.6147-0.6223-0.6223-0.0709-0.0709-0.1646-0.1646-0.4037-0.4037-12.190-12.190-2.148-2.14810.04210.042 zearalanonezearalanone-0.4088-0.4088-0.5095-0.5095-0.6254-0.6254-0.6117-0.6117-0.4218-0.4218-0.2544-0.2544-0.3338-0.3338-0.4040-0.4040-11.722-11.722-1.808-1.8089.9149.914 zearalenone zearalenone -0.4201-0.4201-0.5000-0.5000-0.6295-0.6295-0.6155-0.6155-0.4277-0.4277-0.0919-0.0919-0.1465-0.1465-0.4120-0.4120-11.882-11.882-2.539-2.5399.3439.343 玉米赤霉醇类药物的结构信息 Table 4. Pearson Correlation analysis for molecular descriptors and antibody recognition abilityTable 4. Pearson Correlation analysis for molecular descriptors and antibody recognition ability V V H H LogPLogP R R MWMW S S E E Q Q O1O1 Q Q O3O3 Q Q O14O14 Q Q O16O16 Q Q O18O18 Q Q C11C11 Q Q C12C12 Q Q C17C17 D D 18-1418-14 D D 18-1618-16 Person Person CorrelationCorrelation -0.002-0.002 -0.35-0.35 -0.54-0.54 0.540.54 -0.10-0.10 0.880.88 0.250.25 -0.07-0.07 0.120.12 0.070.07 -0.06-0.06 -0.12-0.12 -0.28-0.28 0.510.51 0.400.40 0.050.05 -.001-.001 -0.22-0.22 Sig.(2-tailed)Sig.(2-tailed)0.9970.9970.490.49 0.260.26 0.260.26 0.840.84 0.010.01 0.630.63 0.880.88 0.820.82 0.890.89 0.900.90 0.810.81 0.580.58 0.290.29 0.420.42 0.910.91 0.980.980.670.67 Z H Wang， J Z Shen. 2009. Journal of Molecular Recognition, submitted. 疏水性 体积 偶极距 分子 距离 电量 相关 系数 获得的分子结构信息，已用于半抗原的合理设计 单 克 隆 抗 体 制 备 过 程 脾细胞 杂交瘤细胞 基因重组抗体制备 噬菌体展示抗体库淘选策略 scFv 双特异性单链抗体制备策略 ScFv 1 Linker ScFv 2 Bispesific scFv Broad-specificity antibody pCANTAB 5E- bispesific scFv 磺胺类喹诺酮类 识别磺胺类 和喹诺酮类 抗体评价及指导抗体定向改造 CoMFA 初步测定 抗体特性 3D-QSAR 重组抗体 Docking 获取兽药-抗体互 作主要力场 预测抗体 三维结构 互作模型 重组抗体定向改造 同源模拟 获取兽药-抗体互 作结构信息 推测兽药-抗体间 发生作用的 氨基酸性质 推测兽药-抗体间 发生作用的 氨基酸位点 ELISA 受体抗体（Acceptor） UniSenesor公司研发了基于受体的可同时检测13种青霉素 和四环素两类药物的试纸条产品中国农大和北京维德维康 公司合作研发可同时检测15种青霉素和头孢类药物的试纸 条产品 受体作为特异性识别的生物大分子，因其分离纯化及体外 构建均较复杂，应用于免疫分析的报道很少 Twin Sensor BT 放射性受体分析法 1978年美国波士顿大学教授Charm发明 受体分析法 C H A R M I 是专用于牛奶中一内酰胺抗生素残留 检测方法， 也是 美国 A O A C承认的第一个快速测定 法， 这个方法非常快速和灵敏，一个奶 牛样品分析 只需 1 5分钟时间 目前，CHARM被多国政府的农业部和卫生部采用作为的标准方法 如我国: 四环素类（SN/T 2309-2009），-内酰胺类(GB/T 21174-2007)，磺胺类(GB/T 21173-2007) 细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合，进 而引起生物学效应的特殊蛋白质 微孔板检测系统 基于膜的检测系统 表面等离子共振传感器 侧流层析技术免疫渗滤技术 荧光分析系统 CHARM原理 受体分析法的优势：可以检测同一类抗生素 难点：受体的制备 检测方法的应用 目的基因的调取 目的蛋白活性鉴定 目的蛋白的表达及纯化 表达载体的构建 基于受体的快速 检测方法建立 检测方法的优化 青霉素等-内酰胺类抗生素通过与细菌膜蛋白 结合，抑制细菌细胞壁的生物合成，引起细菌细胞 死亡从而发挥杀菌作用的。这种细菌蛋白被命名为 青霉素结合蛋白(Penicillin-Binding Protein，PBP) 2001年发现了肺炎链球菌野生R6株5个编码明确 的青霉素结合蛋白的基因，其中PBP 2x对青霉素类 和头孢类抗生素都具有很高的敏感性 青霉素结合蛋白识别-内酰胺药物列表 基本原理 目前常用的主要为为ELISA试剂试剂 盒。在测测定时时，把受检标检标 本（测测定其中的 抗体或抗原）和酶标标抗原或抗体与固相载载体表面的抗原或抗体起反应应， 结结合在固相载载体上的酶量与标标本中受检检物质质的量有一定的比例，加入 酶反应应的底物后，底物被酶催化变为变为 有色产产物，产产物的量与标标本中受 检检物质质的量直接相关，根据颜颜色反应应的深浅进进行定性或定量分析。 （1）试剂盒 3 、试剂试剂 盒、试纸试纸 条研制 1、加入待测测物；2、加入抗体；3、加入酶标标二体；4、加入底物；5、加入终终止液 目前试剂试剂 盒 最常用方法 为为间间接竞竞争 ELISA法，其 他还还用直接 法、夹夹心法 等。 优优点 灵敏度高，特异性强，可进进行定性和定量 测测定 检测检测 方便、快捷，一般1-2个小时时就能出结结 果 对对操作者和实验实验 室条件要求不高 可以用于大量样样本的快速筛选筛选 试剂试剂 盒组组成 96孔酶标版 样品稀释液 标准溶液 底物溶液 终止液 酶标二抗工作液 浓缩洗涤液 抗体工作液 试剂试剂 盒检测检测 需要的仪仪器 恒温摇摇床 离心机 恒温培养箱 涡动仪涡动仪 酶标标分析仪仪 移液枪枪 试剂试剂 盒检测检测 所需试剂试剂 主要用于复杂样品（如 肌肉、肝脏等）的前处 理。大多为常规有机或 无机溶剂， 1、甲醇 2、乙腈 3、乙酸乙酯 4、磷酸盐缓冲溶液 5、 YP1 YP2 YP3 YP4 YP5 YP6 YP7 YP8 YP1 YP2 YP3 YP4 YP5 YP6 YP7 YP8 YP9 YP10 YP11 YP12 YP13 YP14 YP15 YP16 YP9 YP10 YP11 YP12 YP13 YP14 YP15 YP16 YP17 YP18 YP19 YP20 YP21 YP22 YP23 YP24 YP17 YP18 YP19 YP20 YP21 YP22 YP23 YP24 YP25 YP26 YP27 YP28 YP29 YP30 YP31 YP32 YP25 YP26 YP27 YP28 YP29 YP30 YP31 YP32 YP33 YP34 YP35 YP36 YP37 YP38 YP39 YP40 YP33 YP34 YP35 YP36 YP37 YP38 YP39 YP40 BZ1 BZ2 BZ3 BZ4 BZ5 BZ6 阳性 阴性 BZ1 BZ2 BZ3 BZ4 BZ5 BZ6 阳性 阴性 A B C D E F G H 123456789101112 由低到高的标准溶液， 用于绘制标准曲线 阳性添加样 品孔 阴性添加样 品孔 实测样品区， 最多可检测40 个样品 酶标板实际检测布局 试剂试剂 盒一般操作步骤骤 1、向酶标标板微孔中加入标标准品溶液或样样本溶液，再加入一 抗，用盖板膜封板，37恒温箱中孵育； 2、倒出孔中液体，加入浓缩浓缩 洗涤涤液，30 s后倒出孔中液体 ，如此重复操作，用吸水纸纸拍干； 3、加入酶标标二抗，37恒温箱中孵育； 4、倒出孔中液体，重复洗涤涤步骤骤； 5、加入底物显显色液A液，底物显显色液B液，轻轻轻轻 振荡荡混匀， 37恒温箱避光显显色15 min； 6、加入终终止液，轻轻轻轻 振荡荡混匀； 7、用酶标仪标仪 ，测测定每孔吸光度值值。 以检测标检测标 准浓浓度(g/L)的自 然对对数值为值为 X轴轴，百分吸光 度值为值为 Y轴轴，绘绘制标标准曲线线 图图。相对应对应 每一个样样品的 浓浓度(g/kg)可以从标标准曲线线 上读读出。也可以用回归归方程 法，计计算出样样本溶液浓浓度。 利用计计算机专业软专业软 件，更 便于大量样样品的快速分析。 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 103090270810 待测测物浓浓度（ ppb） 吸光度（% ） 1 试纸条结构 基本原理 采用竞争法，样品滴入后，在层析作用下经胶体金标记抗体的结合垫，再 流经包被抗原和二抗的T线和C线，若样品中含有药物，药物与金标抗体结 合后不再与抗原反应，T线不显色；若不含药物，则金标抗体与抗原反应 ，T线显色；无论有无药物，二抗与金标抗体均反应，即C线显色。 （2）试纸试纸 条 优优点 灵敏度高，特异性强 检测检测 方便、快捷，一般3-5分钟钟就能出结结果 几乎不需要任何仪仪器设备设备 可用于大量样样本的快速筛选筛选 ，适用于现场检测现场检测 试纸试纸 条组组成 试纸条的一般检测步骤 1、样品前处理 对牛奶、蜂蜜