小鼠骨髓细胞染色体标本制备和核型分析课件

小鼠骨髓细胞染色体标本的 制备/观察/核型分析 武汉大学生命科学学院 染色体技术的发展 n1920年提出； n直到1956年，Albert Levan和华裔学者蒋有 兴应用低渗处理、秋水仙素和植物凝激素， 才使该技术得到了实质性的发展和完善； n20世纪70年代，出现了多种染色体显带技术 ，提高了染色体分析的精确度； n20世纪80年代中期，荧光原位杂交、显微切 割及染色体涂染等新技术的出现，使染色体 细胞水平的研究与分子水平的探索衔接起来 。 染色体技术的应用及其意义 染色体技术应用领域：临床医学、病毒学、药 理学、遗传毒理学、特殊细胞的标记、杂种细 胞的鉴定等。 染色体技术应用意义： (1)用于染色体组型分析； (2)物种的特征及种属亲缘关系； (3)分析物种的变异和进化过程； (4)识别单条染色体及基因定位； (5)染色体疾病研究、肿瘤学研究及产前诊断 ； (6)环境毒物、临床药物毒性检测。 n染色体核型：指一个物种所特有的染色体数 目和每一条染色体的形态特征。-人类体 细胞中共有23对染色体，22对常染色体，一 对性染色体。 n核型分析：将待测细胞的核型进行染色体数 目、形态特征分析的过程称核型分析。 n核型模式图：是指将一个染色体组的全部染 色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形 态等特征排列起来的图像。 常用实验生物和人细胞DNA含量 与染色体数目 物 种染色体数目DNA含量（ bp） 果蝇 海胆 蛙 小鸡 小鼠 玉米 人 8 52 26 78 40 20 46 1.4108 1.6109 4.5109 2.1109 4.7109 3109 3.2109 n数目 （2n=？） n长度 （绝对长 度、相对长度） n着丝粒位置 （ MSMSTT） n随体与次溢痕的 数目、大小和位 置 n带型分析 染色体的特征 染色体的形态类型染色体的形态类型 1.001.67 1.683.00 3.017.00 7.01 染色体观察及核型分析 染色体技术在临床 医学方面的应用 46,XY,t(10;13)(q26;q21) 21三体核型 遗传病的诊断 (顺铂引起的小鼠染色体畸变) 染色体技术在药理学及毒理学方面的应用 中国水韭属植物体细胞中期分裂相 A. 云贵水韭; B. 高寒水韭; C. 台湾水韭; D. 中华水韭 物种的特征及种属亲缘关系 分析物种的变异、进化过程 染色体标本材料来源及制备过程 u植物细胞染色体制片技术(根尖、花粉母细胞等) 前处理-酶解去壁-低渗-固定-解离-染色-压片 u动物染色体制片技术(骨髓细胞、体外培养细胞等) 取骨髓细胞(体外培养细胞)-低渗-固定-滴片-染 色 u人体染色体制片技术(体外培养组织细胞、外周血淋巴 细胞、胸腹水细胞、胎儿绒毛标本、实体瘤标本、羊水细 胞、及皮肤、肝、肾标本) 快速法：注射秋水仙素-低渗-固定-滴片-染色 一、目 的 要 求 1. 掌握小鼠骨髓细胞染色体标本的 制备方法； 2.掌握染色体分组特征, 对染色体核 型进行分析; 3.了解并制备小鼠染色体核型图。 二、实 验 原 理 染色体的形态结构在细胞增殖周期中是不断地运 动变化的，一般在有丝分裂中期，染色体的形态 最典型、最易辨认和区分。因此，制备染色体标 本获取的是中期细胞。 用适量的秋水仙素溶液注入动物腹腔内，可以阻 止分裂细胞纺锤丝的形成，从而积累大量处于分 裂中期的细胞。骨髓细胞是一种增殖细胞，利用 上述原理，通过常规的制片方法，观察小鼠骨髓 细胞的染色体。 三、染色体制备的实验材料、试剂和用具 实验材料： 体重1825g的小白鼠； 实验试剂： 200g/ml秋水仙素、生理盐水、0.075M KCl 低渗液、Carnoy固定液（甲醇：冰乙酸=3：1） 、pH6.8磷酸缓冲液、Giemsa原液； 实验用具： 眼科剪、眼科镊、草纸、1 ml注射器、 10 ml 注射器、10 ml刻度离心管、低速离心机、恒温水 浴锅、温度计、酒精灯、吸管、载玻片、染色架 、100 ml盐水瓶、定时钟、废液缸、显微镜。 预热的0.075M KCl低渗处理 预固定 37水浴 16min 1ml Carnoy 7ml Carnoy液 15 min 7ml Carnoy液 15 min 固定 重固定 制备细胞悬液 滴片、凉干、 Giemsa染色 加0.2ml 新选固定液 视细胞量 离心并弃上清 1000 r/min 10min 小鼠按2g/g.bw 腹腔 注射秋水仙素处理2.5h 收集细胞于10ml离心管 1500 r/min 8min 脱臼法处死小鼠取 出完整股骨并擦净 7ml生理盐水 冲洗股骨 离心 离心并弃上清 1000 r/min 10min 离心并弃上清 1000 r/min 10min 四、实 验 步 骤 1. 取材前小鼠按2g/gBW 腹腔注射200g/ml秋水仙素作用2.5 小时。 2. 取材：用颈椎脱臼法处死小鼠，取出完整股骨并纱布 擦净。 3. 收集细胞：剪去股骨两头，用生理盐水冲洗股骨髓于离心管 中，反复数次，至骨髓发白，15002000r/min离心8 min， 弃上清。 4. 低渗处理：将约7ml预热37C的低渗液加入离心管中，吸 管混匀，再置于37C 恒温水浴锅中保温15min(中途用吸管 混匀一次)。 5. 预固定：取出离心管，向管底加入1ml新配制的固定液(甲 醇：冰乙酸=3：1)，混匀，平衡，8001000 r/min离心10 min，弃上清。 6. 固定：向沉淀物中加入新鲜固定液5ml，用吸管轻轻吹打均 匀，室温静置15min，平衡后8001000 r/min离心10 min， 弃上清。 7. 再固定：方法同步骤6。 四、实 验 步 骤 (续) 8. 制备细胞悬液：弃上清，留下沉淀物，加固定液 0.20.3ml，用吸管轻轻吹打均匀。 9. 滴片：取干净湿冷玻片，将其倾斜30，取少许细胞 悬液于玻片上一定距离23滴于载玻片上(不要重叠) ，用口轻轻吹散，在酒精灯火焰过几下。 10. 染色：在玻片标本上滴加Giemsa染液(Giemsa原液 ：pH6.8磷酸缓冲液=1：9)并铺匀，染色15min，用 细自来水缓缓冲去染液至干净，晾干。 四、实 验 步 骤 (续) 11. 小鼠骨髓细胞染色体观察 （1）小鼠骨髓细胞染色体计数：选择20个 染色体形态较典型、分散较好的分裂相计数 小鼠骨髓细胞的染色体数。 （2）小鼠染色体形态的观察：小鼠的染色 体呈“U”形，全部为端部着丝粒染色体。可 配成20对，分成4组，其中一对为性染色体。 X染色体大小在56号之间，Y染色体最小。 四、实 验 步 骤 小 鼠 骨 髓 细 胞 染 色 体 图 五、注 意 事 项 固定液和Giemsa染液须现配现用； 低渗时间应掌握准确(？)； 低渗后的细胞吹打时动作要轻，离 心速度不能高于1000 r/min (？) 。 1.材料：染色体的中期分裂相照片。 2.软件：Image J (/ij/) 核型分析 1、染色体的测量 测量长短臂