实验一_质粒dna的提取及检测课件

实验一 质粒DNA的提取及检测 质 粒（plasmid） n是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭闭合、 环环状的双链链DNA分子（cccDNA），能自主复 制并能稳稳定遗传遗传 的遗传遗传 因子。 n常常编码编码 一些对对宿主有利的酶的基因，这这些 基因的表型包括抗生素抗性、产产生抗生素、限 制酶、修饰饰酶等 n质质粒的复制：严紧严紧 型复制（1n个） 松弛型复制（20个以上） 常用的质粒载体 n是通过过DNA重组组技术术构建而成的。pUC18, pUC19 质粒提取的思路 n质质粒的特性：共价、闭闭合、环环状的小分子量 DNA n要去除的物质质： n 蛋白 n 基因组组DNA n 脂类类及小分子杂质杂质 n RNA 第一部分 质粒DNA的提取 一目的 n了解提取质粒的原理。 n学习和掌握质粒提取的方法和技术。 n细菌的生长和质粒的扩增 n菌体的收集裂解及质粒DNA的分离 n质粒DNA的纯化 二原理 n碱变变性法提取主要是利用共价闭闭合环环状质质粒与线线性染色质质 在拓扑学上的差异： n在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体 DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态； n将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之 间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污 剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通 过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白 质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质 粒DNA（可省略）。 原理示意图 返回目录 返回原理 三、实验仪器、材料与试剂 （一）仪仪器：恒温摇摇床、台式离心机、高压灭压灭 菌锅锅 （二）材料：含pUC18（或其他）质质粒的大肠肠杆菌、 （三）试剂试剂 ： LB培养基（液体、固体） 溶液I 溶液II 溶液III TE(pH8.0) 溶液 I n50 mmol/L 葡萄糖/1mg/mL溶菌酶 n25 mmol/L TrisCl (pH8.0) n10 mmol/L EDTA (pH8.0) n在10 lbf/in2(6.895104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保 存于4。 n作用：裂解细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液 II n0.2 mol/ L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释) n1% SDS n作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性 。 溶液 III n5mol/L 乙酸钾60ml n冰乙酸11.5ml n水28.5ml n所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为 5mol/L。 n作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS线 性DNA沉淀，K可中和DNA TE(pH8.0) n10 mmol/L TrisCl (pH8.0) 1 mmol/L EDTA (pH8.0) nRNA酶（降解RNA） n作用：稳定 特点：小量质粒制备、最简便、快捷 应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提） 测序、转染（细提） 质粒提取试剂盒 常用方法：小量碱裂解法 满足不同需要的试剂盒 纯化原理：离子交换柱层析等 小量制备质粒kit 大量制备质粒kit 去除内毒素制备质粒kit 可用于大部分分生实验 四、实验步骤 接含pUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜 取1.5 ml菌液入1.5ml的离心管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体 100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温10min 加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体 加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管 上清加等体积的酚：氯仿（振荡混匀） 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管 上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴 30min 12000rpm，离心15min 沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（轻弹混匀、离心） 12000rpm，离心10min 晾干沉淀 沉淀用20ul TE溶解 沉淀法 吸附管用BL 500ul平衡 取上清加入吸附管 5000rpm 离心5min 加PW漂洗液500ul，放置2min 10000rpm 离心5min，晾干 加30ul TE，10000rpm 离心5min（收集到干净的EP管中） 吸附法 第二部分 琼脂糖凝胶电泳 相关知识 n电电泳：泳动动速度决定于？ n琼琼脂糖凝胶 天然琼琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼琼脂糖（ Agarose ，约约占80）及琼琼脂胶（Agaropectin）组组 成。琼琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质质， 不带电带电 荷。而琼琼脂胶是一种含硫酸根和羧羧基的强酸性 多糖，由于这这些基团带团带 有电电荷，在电场电场 作用下能产产生 较较强的电电渗现现象，加之硫酸根可与某些蛋白质质作用而 影响电电泳速度及分离效果。琼琼脂糖透明无紫外吸收， 因此，目前多用琼琼脂糖为电为电 泳支持物进进行平板电电泳。 琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 n不同构型DNA的移动动速度依次为为：共价闭环闭环 超螺旋DNA（cccDNA）直线线DNA（LDNA ，2条链发链发 生断裂）开环环的双链环链环 状DNA（ ocDNA，1条链发链发 生断裂）。 影响迁移率的因素 nDNA分子的大小、琼琼脂糖凝胶的浓浓度、DNA 的构象、所加电压电压 （一般5V/cm）、电场电场 方向 、嵌入染料的存在、电电泳缓缓冲液的组组成等。 一、实验目的 n通过过本实验实验 学习琼习琼 脂糖凝胶电电泳检测检测 DNA的方法和技术术。 二、实验原理 nDNA在琼琼脂糖凝胶中泳动时动时 有电电荷效应应和分子筛筛效应应。 n核酸为为两性分子，在pH3.5时时，整个分子带带正电电,pH8左右 时时，碱基几乎不解离，整个分子带负电带负电 。 n在碱性环环境下，相同碱基数量的双链链DNA几乎具有等量 的净负电净负电 荷，能以同样样的速度向正极方向移动动。具有不 同的相对对分子质质量的DNA片段泳动动速度不一样样，可进进行 分离。DNA分子的迁移速度与相对对分子质质量的对对数值值成 反比关系，可以近似用于估算分子的大小。 n可以分离相对对分子质质量相同，但构型不同的DNA分子。 共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线DNA（LDNA， 2条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条 链发生断裂）。 质质粒的电电泳 质粒DNA的3种形式泳动速度:超螺旋线性开环 质粒DNA的存在形式有3种: 1、共价闭环DNA:常以超螺旋 形式存在 2、开环DNA:质粒DNA两条链 中有一条发生一处或多处断裂 ，因此可以自由旋转从而消除 张力,形成松弛的环状分子 3、线性DNA:因质粒DNA的两 条链在同一处断裂而造成. 开环 超螺旋 线性 三、仪器、材料与试剂 n（一）仪仪器： 稳稳流稳压电稳压电 泳仪仪 n（二）材料 1.自已提取的质质粒DNA 2.相对对分子质质量标标准品 （三）试剂试剂 15TBE储储液(pH8.0) 使用时时稀释释 10倍，成1TBE。 2凝胶加样缓样缓 冲液（loading buffer） 3. 1% 琼琼脂糖 4. 10mg/ml溴化乙锭锭溶液（EB），4保存。用时时稀释释成 5ug/ml的EB。 四操作步骤 琼脂糖（1%）凝胶电泳 1.称取一定量琼脂糖凝胶，按1g中100ml的量加入电泳 缓冲液，微波炉中加热约2min，使琼脂糖溶解； 2.溶液冷至60 ，加入 EB至终浓度为0.5g/ml，混匀， 注意戴手套操作； 3.将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为0.3-0.5cm， 迅速插上梳子，检查有无气泡； 4.待凝胶完全凝固后（约30min），小心取出梳子，将凝 胶板置于电泳槽中，加入电泳buffer，让液面高出胶面 1mm； 5.在DNA样品（20ul）中加入6 loading buffer（4ul） ，混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压100V ； 6.根据指示剂的位置，判断是否终止电泳; 7.在紫外灯下凝胶成像仪上观察电泳结果。 五、实验结果与讨论 n根据观察结果，绘图。 n分析自提质粒的情况。 图1的电泳结果不是很好，一方面上样量太大不同构象的质粒 分子没有分开；另一方面有些样品RNA去除得不好，在电泳 结果上可以看到大团的荧光；此外还要注意上样的技巧，上 样后稍沉降一会，使样品均匀地分布于上样孔的底部再开始 电泳，这样走出的条带会