流式细胞分析分选原理课件

流式细胞仪工作原理 流式细胞术的原理 流式细胞术（FCM）是一 种能对单个细胞、分子和 生物颗粒（微生物）进行 多参数快速检测的新型分 析和分选技术。近几年随 着多种单克隆抗体的成功 制备和多种荧光素的应用 。FCM逐步运用于对疾病 诊断和治疗监测的临床检 验常规工作。 流式细胞仪与显微镜 光源激光 自然光、灯光、氙(汞)灯 对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子 承载工具 载(盖)玻片鞘液及流动室 检测信号 光学信号形态及染色 放大方式 PMT，放大电路目镜X物镜 统计 人工，200 计算机，5000 结果 简单，单参数多参数，综合分析 基本原理 流路 流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/ml 光路 光源 检测信号 光电倍增管PMT HV 电路 放大电路HV及GAIN 增益 A/D转换 统计：计算机 流式细胞仪 光路流路电子 软件 流路 光路 电路/ 电子 软件 流 路 单细胞悬液 大多数仪器是在50-300 m 大小的孔径中 ,将细胞悬液注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦 FLOW CELL Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 流路 光路 电路/ 电子 软件 光 路 光源 检测信号 散射光信号 FS: 前向角散射光 SS: 侧向角散射光(90度散射光) 荧光信号 荧光染料 光学滤片 颜色补偿 光 路 光源 与通过的细胞聚焦在同一点上 激光 空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green, 水冷 Innova300系列Innova70系列 固态 检测信号 散射光信号前向散射光(FS) FS-Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光 检测器 FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形 状及 optical homogeneity 有关 FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小 前向散射光 散射光信号 侧向散射光 SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器 SS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状 及 optical homogeneity 有关 SS用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少, 核质比 侧向散射光 90 Degree Scatter 0 200 400 600 8001000 8 15 20 30 40 50 100 200 1000 Lymphocytes Monocytes Neutrophils Side Scatter Projection Light Scatter Gating Scale 光路-荧光信号 每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激 发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即 是它特定的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检 测)这些光学信号 荧光染料的特性 激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION) Fluorescence emitted by each fluorochrome is usually detected in a unique fluorescence channel. The specificity of detection is controlled by the wavelength selectivity of optical filters and mirrors. Absorption spectrum: Range over which a fluorescence compound may be excited Emission spectrum: Range of emitted wavelengths for a particular compound 5 Color Single Laser (488nm) FITC/PE/ECD/PC5/PC7 4 Color Single Laser (488nm) FITC/PE/ECD/PC5 常用荧光染料的特性 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 红 PI 488 620 DNA染色 橙红 PECy7 488 755 免疫荧光 深红 PerCP 488 670 APC 633 670 光路 - 滤片特性 当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过 一定波长的光,同时也可以阻断并折射该 波长以下的光 这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter) 标准带通滤片 band pass 光源通过的光谱 630/30 nm BP 615-645 nm light Source light Passed light Certain colors absorbed Absorbance filter 488 DL488 BK 550 DL 525 BP 600 DL 575 BP 640 DL 620 BP 675 BP Unique 4-Color Single Laser Design Air-cooled Argon Ion Laser Beam Shaping Lenses High Sensitivity Quartz Flow Cell Forward Scatter Detector Side Scatter Detector 525BP FL1 (FITC) 575BP FL2 (RD1) 620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5) 488DL 488BK 550DL 600DL 645DL PC7 Air-cooled Argon Ion Laser Beam Shaping Lenses High Sensitivity Quartz Flow Cell Forward Scatter Detector Side Scatter Detector 525BP FL1 (FITC) 575BP FL2 (RD1) 675BP(PC5) 750BP FL4 (PC7) 488DL 488BK 550DL 600DL 700DL With Thanks to Dr. Frank Schnieders Gentherapie Gruppe Abteilung Molekulare Zellbiologie Institut fr Medizinische Biochemie und Molekularbiologie Universittsklinikum Hamburg-Eppendorf EGFP, EYFP and 7-AAD With EPICS XLTM and EXPO32TM ADC-Software HEK293 Human Embryonal Kidney Cells 293 Filter Set BP 510LAF21 BP 550LAF30 Dichroic Mirror 525DRLP Cell Viability with 7-AAD HEK293-cells with EYFP Transfection HEK293-cells with EGFP Transfection Mixture of EGFP- and EYFP-transfected HEK293-Cells EGFP . Enhanced Green Fluorescent Protein (Ex 488; Em 507 nm) EYFP . Enhanced Yellow Fluorescent Protein (Ex 513; Em 527 nm) 7-AAD .7-Aminoactinomycin (Viability Stain ; Ex 546; Em 647 nm) emission intensity wavelength FLBFLA 颜色补偿 减法颜色补偿 减法补偿 去除叠加信号,在使用双色以上时会产生减得过多的错误 BD FACSCalibur 补偿试剂 FITC PE CorrectCorrect Over-compOver-comp FITC PE Under-compUnder-comp FITC PE 全矩阵颜色补偿 全矩阵 在每个PMT上对于每一个荧光计算 “叠加荧光素” 的比率 通过矩阵去除或加上信号 EPICS XL Cytomics FC500 Gallios/Navios CD45-ECD 流路 光路 电路/ 电子 软件 电路及电子系统-光电倍增管 Photomultiplier tube (PMT) 将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号 不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程 单参数直方图 流路 光路 电路/ 电子 软件 软件 基于Windows 平台 软件界面简单，易学易用 目前流式获取和分析最友好的软件包，涵盖所有数据和图形处理功能 易于与医院内LIS系统相连 直观拖拽方式调节电压、补偿，支持时时/自动/脱机补偿 支持多文件分析报告，内置FlowPage功能，方便中文临床报告的生成 和输出 PRISM浓缩柱形图功能便于结果统计，兼容Office，支持PDF 内置质控功能 Quickset直观的电压调节 QuickComp直观的补偿调节 补偿前 补偿后 PRISM浓缩柱形图 一张图上显示多达1024个表型组合结果（十色分析，210分析组合） 将实验所分析的所有细胞数据结果简单地浓缩在一张直方图上 能直接读出各种阴性或阳性组合的结果 清晰直观且便于数据的保存 颜 色 点 图 组 合 2122 3323 46