肿瘤干细胞与肿瘤发生课件

肿瘤干细胞与肿瘤发生 何谓肿瘤？ 肿瘤（tumor）是机体在各种致瘤因素作 用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生 长的正常调控，导致克隆性异常增生而形成的新 生物(neoplasm)。 恶性肿瘤具有无限增殖、异常分化和侵袭、 转移性生长的特点。 肿瘤的流行病学显示： 肿瘤的发病率正在不断地上升，已成为严重危 害人类健康的常见疾病； 世界卫生组织(WHO)，2000年癌症的发病数1000 万，死亡620万；预测2020年，癌症的发病人数将 增加50，达1500万； 我国卫生部公布，癌症的发病率已超过了心血 管疾病，上升到第一位； 一、肿瘤的起源： n 癌细胞来自何处？ 早在十九世纪八十年代，科学家们就从恶性 畸胎瘤与胎儿组织的相似性，特别是癌症组织与 胚胎组织相似的低分化度，认识到了这两者可能 存在紧密的关系。 细胞分化(Cell differentiation) 在个体发育中，由一种相同的细胞类型经细胞分裂后逐渐 在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生各不相同的细胞 类群的过程 cell differentiation。 n细胞分化是多细胞生物发育的基础与核心； n细胞分化的关键在于特异性蛋白质合成； n合成特异性蛋白质，其实质在于组织特异性基因在时间和空间上的 差异性表达； n差异性表达的机制是由于基因表达的组合调控。 n细胞癌变是正常细胞分化机制失控的表现 细胞分化是基因选择性表达的结果 分子杂交技术检测基因及其表达 组织特异性基因与看家基因 n看家基因(house-keeping genes)： 是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维 持细胞基本生命活动所必需的； n组织特异性基因(tissue-specific genes) 或称奢侈基因 (luxury genes)： 是指不同的细胞类型进行特异性表达的基因，其产物 赋予各种类型细胞特异的形态结构特征与特异的功能； n调节基因(regulatory gene)： 产物用于调节组织特异性基因的表达，起激活或者起 阻遏作用。 一种见解认为肿瘤由组织内成熟细胞重新去分化（de- differentiation）变为幼稚细胞并具有分裂能力而来； 另一种见解则认为肿瘤来自组织内已存在的干细胞 (stem cell)。干细胞在特定的分化水平停止分化或分化失 常（dys-differentiation）产生肿瘤。 目前研究更倾向肿瘤起源于干细胞。 肿瘤细胞的来源： 二、干细胞与肿瘤干细胞 n 干细胞（Stem cell, SC）： 干细胞是具有自我更新、多向分化潜能的细胞群,即 这些细胞可通过分裂维持自身细胞的特性和大小，又可 进一步分化为各种不同的功能细胞, 形成多种组织和器 官，从而在组织器官发生和修复等方面发挥积极作用。 自我更新是干细胞至关重要的一个生物学特性, 正 常干细胞自我更新与分化保持平衡, 维持内环境稳定。 n 分类： （1）全能干细胞：包括： 胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES细胞） 生殖干细胞（embryonic germ cells, EG细胞） 具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型，进一步形 成机体的任何组织和器官。 （2）多能干细胞： 具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整 个体的能力。 （3）专能干细胞：只能向一种或密切相关的几种类型的细胞分化。 Hematopoietic Stem Cell Lineage Adult Stem Cells Have Been Found in Many Tissues SkinIntestine 正常情况下，成体干细胞与机体组织的更新 有着密切关系，一个成体干细胞可以分化为一种 过渡性自我更新细胞，这种细胞虽然有一定的分 化度，但它却可以通过不对称的方式分裂，形成 一个新的过渡性自我更新细胞和一个可以继续分 化且具有组织特异性的细胞。 n人体组织内都含有一定数量的自我更新细胞，这些细胞每 时每刻都在对机体的损伤和衰老进行更新和修复。但是组 织内的成体干细胞在一般情况下都处于静息状态，不会进 行分裂。 n只有当体内的平衡被打破，即自我更新细胞大量减少，或 机体对过渡性自我更新细胞的需求迅猛增加时，成体干细 胞才会从静息状态重新进入细胞周期，开始以极快的速度 进行分裂。需要注意的是，这种成体干细胞的复苏，很可 能与肿瘤的发生相关。 n 肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs) n肿瘤中的一小部分具有无限增值能力，并有形成肿瘤能 力的细胞，也称癌干细胞。 nCSCs具有干细胞性质，有自我更新的能力, 能够产生与 上一代完全相同的子代细胞,并有多种分化潜能和高度增 殖能力，使肿瘤在体内不断扩大, 或形成新的肿瘤。 CSCs具有启动和重建肿瘤组织表型的能力。 肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。 根据大量的研究提出了这样一个假设，即肿瘤 之所以能具有无限增殖能力，其罪魁祸首在于肿瘤 细胞中只占极少数量的肿瘤干细胞，正是这类细胞 在人体中以极快的速度不断复制出有基因突变的细 胞，导致了器官正常功能的紊乱，并最终导致机体 死亡，因此，从这个意义上说，肿瘤干细胞也可以 成为死神的代言人。 CSCs 与干细胞的相似性 (1) 具有相似的生长调节机制: 研究证明许多与癌细胞相关的经典信号转导途径也调控正常干 细胞的生长发育, 如癌基因bcl-2的表达不但能阻止肿瘤细胞凋亡, 也可使造血干细胞的数量增加。 (2) 具有很强的分化能力: 因为分化细胞已失去或增殖能力有限, 如发生转化需首先突变 获得增殖能力, 而干细胞具有较强的自我更新机制, 在较长的生存 周期中更易累计突变。 (3) 都具有不同的表型和异质性。 (4)均有无限增殖能力、迁移( 转移) 能力。 (5)两者在一定条件下可以相互转化： 生殖嵴或胚胎植入鼠体内可以诱导成为畸胎瘤, 而畸胎瘤细 胞注入鼠囊胚内细胞团可以形成正常胚胎。 (6)肿瘤干细胞具有许多干细胞共同的特异性标志物： 如nestin、CD133、Sox2、母源性胚胎亮氨酸拉链激酶等。 (7)某些恶性肿瘤可以自动消失或者经过诱导剂的诱导而继 续分化成熟为正常的组织细胞。 如视网膜神经母细胞瘤、恶性黑色素瘤、脂肪母细胞瘤等。 CSC 不同于干细胞的特点 ( 1) 多次突变导致细胞自我更新信号转导途径的负反馈机制已被破坏 。 ( 2) 缺乏分化成熟的能力, 因此肿瘤细胞大多数是低分化或未分化的 细胞。 ( 3) 肿瘤细胞也有保持其遗传性的特点, 每次突变所得到的变异的DNA 信号都会在复制中累积。而干细胞能够防止复制错误的发展。 ( 4) 干细胞增殖具有自稳定性, 其数目在机体调控下保持恒定,平均一 个干细胞产生一个子代干细胞和一个特定分化细胞。而肿瘤细胞 却无自稳定性的特点；干细胞具有迁移到特定的组织和器官的特 性,而癌细胞只具有嗜器官和组织转移的能力 肿瘤的形成： n正常干细胞产生多能祖细胞, 继而形成祖细胞 和分化细胞； n干细胞的突变可以引起异常增殖而形成癌前病 变。附加突变使其获得无限增殖, 凋亡缺失, 免疫逃避, 进一步生长为恶性肿瘤。 正常干细胞产生多能祖细胞, 继而形成祖细胞和分化细胞， 干细胞的突变可以引起异常增殖而形成癌前病变， 附加突变使其获得无限增殖, 凋亡缺失, 免疫逃避, 进一步生长为恶性肿瘤. n每个人都有发生肿瘤的遗传学潜能；一生中随时可能产 生突变细胞并形成微小肿瘤灶，其关键是这些起始细胞 能否逃逸免疫、是否及如何呈现侵袭力和逐渐产生转移 表型。 nCSCs肿瘤起始细胞(tumor initiating cells)受到科学 家们越来越多的重视，并期待针对CSCs进行更有效的肿 瘤治疗。 三、肿瘤干细胞的发现 1. Nature,1963,199 : 79-80 Bruce等人发现，由小鼠腹水分离得到骨髓瘤细胞，其中的极少部分 （0.01%1%）可在体外培养实验中形成集落。 2. Science,1977,3:730-737 Hamburger等人发现，在人肺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤等肿瘤细胞的 体外培养实验中，仅有0.1%可形成集落。 具有形成集落的能力 x 系列稀释的小鼠 白血病细胞移植 到同品系的动物 体内，移植细胞 仅有1-4能形 成脾脏克隆。 1958 从小鼠腹水中分离 骨髓瘤细胞,体外集 落培养仅1/10000- 1/1000 癌细胞能形 成集落,而且与在体 内利用脾脏培养的 克隆形成率一致。 1971 从白血病病人中分离出 不同种类的白血病细胞 ，表面标记为CD34 CD38-的细胞移植到 NOD/SCID小鼠后能够形 成克隆，而其他细胞都 不具有肿瘤源性。 1997 正式提出Cancer Stem Cell的概念 2001 从乳腺癌患者分离 CD44CD22-/low的癌细 胞200个，然后移植于 小鼠身上形成乳腺癌 ；再从小鼠乳腺癌内 分离癌细胞200个，又 可形成肿瘤。 2003 白血病干细胞的研究 CD34+CD38-为急性髓系白血病肿瘤干细胞 的特异表面标志，在每一病人的所有血细胞中 只占0.2%1%。 肿瘤干细胞实验证明 4. Bonnet D., Dick J. E., et al., NatMed. 3 (1997) 730. CD133+ CD133- CD133+ 肿瘤细胞（100个）移植到免疫缺陷小鼠脑组织后形成肿瘤 CD133-肿瘤细胞（105个以下）不能形成肿瘤 实体瘤干细胞的证实脑肿瘤 6. Sheila K. S., et al., Nature 432 (2004) 396. 人乳腺癌手术标本 制成单细胞悬液， 流式分群 分离小鼠移 植乳腺癌的 细胞，再次 接种小鼠 不同细胞亚群移植 入NAD/ SCID小鼠 乳腺脂肪组织 CD44CD24/low 细胞接种的小鼠 12w时出现明显 肿瘤 未分类细胞5104 才能形成肿瘤， CD44CD24/low 细胞只需200个即 可在小鼠乳腺中再 次形成肿瘤。 表型相似 包含肿瘤组织的各种成分 乳腺癌细胞是功能上不均一 的成分，仅有少量表达特征 性表面标志的乳腺癌细胞能 在重复移植后重建乳腺癌细 胞型，且具有自我更新和多 向分化能力。 肿瘤中绝大多数细胞没有能力增殖 或形成肿瘤，只有肿瘤干细胞能够 无限增殖，产生更多的肿瘤干细胞 和缺乏肿瘤源性潜力的肿瘤细胞。 肿瘤干细胞的特点： n极强的自我复制更新能力，能够产生与上一代完全相 同的子代细胞。具有极强的致瘤能力。 n不断的分化能力，能够产生不同表型的肿瘤细胞，并 在体内形成新的肿瘤。 n具有与非致瘤细胞不同的表面标志。 n在肿瘤中的所占的比例较少。 n耐药性与抗凋亡特性。 四、肿瘤干细胞的分离纯化 n根据特异的细胞表面标志鉴定肿瘤干细胞 n采用染料Hoechst33342鉴定肿瘤干细胞 n免疫磁株分离方法 n采用BrdU法鉴定肿瘤干细胞 n抗凋亡分选假说等 根据特异的细胞表面标志鉴定肿瘤干细胞 n干细胞研究的发展很大程度上依赖细胞表面分化抗原 的研究进展。因此,肿瘤干细胞分离鉴定的最重要方法 就是确定细胞表面特异性标志,一般原则为结合谱系标 志、正常干细胞的特异标志和正常组织特异性标志等 综合评价。 n目前,已经鉴定出了多种肿瘤干细胞表面标志 n急性髓性白血病：CD34+ CD38- 细胞 n乳腺癌： CD44+ CD24-/low Lineage-细胞 n脑肿瘤：CD133+ n前列腺癌：CD44+/21hi /CD133+ n恶性黑素瘤：CD20+ ABC5+ n肺腺癌：Sca-1+ CD45- Pecam- CD34+ n直结肠癌：CD133+ CD44+ CD166+ 部分肿瘤干细胞表面标志 带有CSCs表面标志抗体的 磁株加入细胞悬液，特异性与肿 瘤干细胞结合，在磁场作用下被 吸附，非CSCs细胞则被洗脱。 免疫磁珠分离（MACS） Hoechst 33342鉴定肿瘤干细胞 n研究者用Hoechst 33342对骨髓细胞染色后发现有一小 部分细胞染色很浅，进一步实验发现这群细胞表达造 血干细胞的表面标志Sca1+ lin-/low，这一细胞群被称为 边缘细胞 (side population，SP) n已经证实SP细胞膜表面有外排泵多药耐药转运子1 (multidrug resistance transporter 1, MDR1)，能外排 Hoechst染料。 干细胞高表达抗药蛋白能够将药物泵出细胞外的特性，用荧光 染料Hoechest 33342对肿瘤细胞进行预染，然后用流式细胞仪进行分 选。 边缘细胞 干细胞 3 采用BrdU法鉴定肿瘤干细胞 nBrdU (溴脱氧尿嘧啶核苷) 是DNA前体胸腺嘧啶核苷类 似物, 通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代 胸腺嘧啶。 nBrdU经活体注射或细胞培养加入后,可利用抗BrdU单 克隆抗体免疫细胞化学染色，显示增殖细胞。如果细 胞迅速分裂,，BrdU则被稀释而检测不到；如果细胞分 裂缓慢，则可以被检测到，这种细胞被称为标记阻滞 细胞( label-retaining cell, LRC) 。现已经在乳腺、皮肤 、肾脏、前列腺、子宫和胰腺等检测到了LRC。 抗凋亡分选假说 n干细胞能通过一些复杂的机制来抵抗凋亡，在诱导凋 亡的条件下，普通肿瘤细胞最终会发生凋亡,而肿瘤干 细胞的比例增加，此时以合适的培养基防止肿瘤干细 胞分化，然后用蛋白芯片或其他方法检测存活细胞的 表面标志，这些标志可能就是肿瘤干细胞的表面标志 。 五、研究肿瘤干细胞的意义 n有望代替肿瘤细胞系，成为更加理想的肿瘤研 究工具。 n用于研究肿瘤的发生机制，有助于研究观念的 转变及对肿瘤本质的理解。 n为临床有效地诊断出恶性生长细胞的存在部位 并进行有效治疗，提供了新的思路。 Tannishtha , Sean JM , Michael FC,et al. Nature,2001,414:105 肿瘤的起源基因突变理论 传统观点 随机学说(Stochastic) 所有肿瘤细胞均存在无限增殖的可能； 但以很小的几率,随机地进入细胞周期增 生分裂 传统观念认为肿瘤形成是所有肿瘤细胞共同 增殖的结果。 传统理论指导下癌症的治疗方法有：放射治 疗法，化疗法，外科手术切除等方法。这些方法 是不加区分的消灭肿瘤细胞来达到一定的治疗。 肿瘤的起源肿瘤干细胞（CSC） Tannishtha , Sean JM , Michael FC,et al. Nature,2001,414:105 肿瘤是在具有无限增殖和 自我更新潜能的很少一部分细 胞的驱动下发生的，这一部分 恶性转化的靶细胞即是肿瘤干 细胞（cancer stem cell）。 新观点 CSC Stewart S. Critical Reviews in Oncology/Hematology,2004,51:1 肿瘤起源于不同分化阶段的干细胞：如果致癌因子作用于未分化的干细胞，干细胞 就成为肿瘤性干细胞而形成恶性肿瘤；如果致癌因子作用于近于终末期分化而仍能 合成DNA的细胞则形成良性肿瘤；如果致癌因子击中的是中间状态的细胞会出现中等 程度分化而介于这两种极端之间的肿瘤。 胚胎干细胞 祖细胞 中间分化 状态细胞 近终末分 化细胞 成熟细胞 n传统治疗的对象是肿瘤的整体。但大多数肿瘤细胞并无肿 瘤源性, 其生长依赖于少量干细胞样的细胞。而目前的治 疗并未有效地攻击这些细胞。 n许多化疗药物靶向正在分裂的细胞。但干细胞大多处于休 眠状态（处于有丝分裂的静止期, 偶尔进行分裂）。这可 能使肿瘤干细胞与其它肿瘤细胞对化疗药物的敏感性上存 在着差异。 肿瘤传统治疗手段失利的原因 Therapeutic Implication Nat Rev Cancer 2003;3:895-902 将治疗的重心转向肿瘤干细胞 n在信号途径的研究中寻找新的诊治靶点。 n诱导CSCs分化。 n需要注意的是, 对于血液系统、肝脏、中枢神经系统等重 要器官, 其治疗既要面向肿瘤干细胞, 又要保护正常的干 细胞。而另外一些器官, 如子宫、乳腺及前列腺等, 暂时 可不考虑正常干细胞的保护问题, 应成为优先研究的方向 。 n可行性：已有研究证实，个别化疗药物既可杀灭白血病干 细胞而又不破坏正常的造血干细胞。 n新近发现, CSCs具有促进血管生成作用。CSCs 在缺氧状态下高表达血管生成因子,提示CSCs在 肿瘤发生和演进阶段有间接促血管生成作用。 n CSCs还可以转化为肿瘤血管干/前体细胞直接 参与血管生成；促使人们重新认识肿瘤发生和 演进机制,给肿瘤传统基础理论甚至近年的抗血 管生成治疗也带来冲击和挑战 CSCs与肿瘤血管形成 CSCs与肿瘤转移 n肿瘤转移呈现一定的靶器官特异性或亲和性； n完成这种转移的瘤细胞实际上是转移性CSCs (metastatic CSCs)或迁移性CSCs (migratory CSCs) n目前肿瘤侵袭和转移机制研究从主要关注整体 瘤细胞遗传特性,转向关注转移性CSCs与靶器 官微环境相互作用。 CSC 与肿瘤耐药性 n研究发现正常干细胞对药物是天然耐受的, 其 最重要的机制是高表达ABC 转运蛋白。 n主要在肿瘤细胞中存在的多药耐药基因（MDR ） 编码的P糖蛋白即为ABC 转运蛋白（ABCB1 和ABCG2, ABCC1）。 n最早发现于细菌，属于一个庞大的蛋白家族，每个成员都 有两个高度保守的ATP结合区（ATP binding cassette） ，故名ABC转运器。 n每一种ABC转运器只转运一种或一类底物，不同的转运器 可转运离子、氨基酸、核苷酸、多糖、多肽、甚至蛋白质 。在膜的发生和功能维护上具有重要的意义。 ABC转运器（ABC transporter） Mammalian MDR1 protein 第一个被发现的真核细胞的ABC转运器是多药抗性蛋白（ multidrug resistance protein, MDR），约40%患者的癌 细胞内该基因过度表达。ABC转运器还与病原体对药物的抗 性有关。 Stem Cells and Drug Resistance of Cancer CSCs与肿瘤免疫 n免疫系统不仅可以保护个体避免肿瘤的发生,也可以编 辑细胞的免疫原性而导致肿瘤的形成,后者即免疫编辑( immunoediting)。 n结合CSCs特性和肿瘤免疫编辑研究进展,可以推