流式细胞仪分析技术及应用课件_2

流式细胞仪分析技术及应用流式细胞仪分析技术及应用 第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理 第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术 第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、免疫检测样品制备 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、免疫胶乳颗粒的应用 四、流式细胞免疫学技术的质量控制 第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用 第五节 流式细胞术在细胞凋亡研究中的应用 前 言 流式细胞术：七十年代发展起来的,集计算机技 术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学 于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。 测细胞大小、内部颗粒性状, 检测细胞表面和细胞 浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,对群体细胞在单细 胞水平上进行分析, 短时间内检测分析大量细胞; 分 类收集某一亚群细胞。 常用的由美国生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton- Dickinson公司(B-D公司)。流式细胞仪主要有两型: 临床型（小型机、台式机）和综合型（大型机、分 析型）。 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对 单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分 选的新技术。 能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功 能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助， 从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选。 细胞不被破坏，测量快速、大量、准 确、灵敏、定量 流式细胞术的特点 高速度：对细胞的标准分析速度达到了2x 104个/min，最大分析速度达到6x 104个/min 。 高灵敏度：一般以能检测到单个微球上最少 标记有异硫氢酸荧光素(FTTC)或藻红蛋白 (PE)荧光分子数目来表示。 高准确度：可检测两个细胞间细胞成分仅相 差1%左右的细胞。 流式细胞术的特点 2011-9-13 分析速度：一般每秒检测1000 5000个细胞,大 型机可达每秒上万个细胞。 荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上5000人工，200 结果多参数，综合分析简单，单参数 流式细胞仪与显微镜的区别 u粒子折射激光产生散射光信号。散射光不 依赖任何细胞样品的制备技术（染色），因 此被称为细胞的物理特性，即细胞的大小和 内部结构。 u散射光与细胞膜，核膜以及细胞结构的折 射性、颗粒性密切相关，细胞形状和表面形 貌也对其产生影响。 主要分为前向散射光和侧向散射 光。 二、散射光的测定二、散射光的测定 前向散射光（forward scatter, FSC）：激光束照 射细胞时，光以相对轴较小角度(0.510)向前 方散射的讯号。用于检测细胞等粒子的表面属性， 信号强弱与细胞体积大小成正比。 FSC不受细胞 荧光染色的影响， 常用于免疫表型分 析的信号处理。 FALS Sensor Laser 前向散射光示意图 侧向散射光（side scatter, SSC）：激光束 照射细胞时，光以90角散射的讯号。用于 检测细胞内部结构属性。 SSC与被测细 胞的颗粒密度和 内部结构有关， 对细胞膜、胞 质、核膜的折射 率更为敏感。 FALS Sensor 90LS Sensor Laser 侧向散射光示意图 FS与SS信号通过 计算机处理，得到FS -SS图，由此可仅用 散射光信号对未染色 的活细胞进行分析或 分选-血细胞分类 的基本原理，但不能 分析表面分子。 淋巴细胞 单核细胞 中性粒细胞 光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受 激发后产生，发射荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通 过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光 和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。 线性放大器和对数放大器 三、荧光测量 l高能态电子回基态，释放过剩能量成为光子。 这种能量的转换称为荧光。 l激发光谱：能够激发荧光物质的波长范围。 l发射光谱：荧光物质的发射波长范围。由于更 多的能量消耗在吸收转换而不是荧光转换中，所 以发射光波长要高于激发光波长。 l光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰 值，所产生的荧光信号愈强。 l流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为488nm 的激光器能够激发一种以上的荧光。 2011-9-13 FITC、PE、PerCP、APC 染料的激发光谱 FITC的发射光波长 530nm，PE发射光波长 570nm。其发射 光波长足够远，可使用不同的检测器来检测。被检测到的荧 光信号数量与粒子中标记上的分子数量成正比。 通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。 四、细胞分选原理四、细胞分选原理 细胞悬液形成液流柱 流动室振动 液流断裂成液滴 空白液滴含细胞的液滴 弃去 偏转落入收集器 压电晶体产生机械振动 不充电充电 （一）分选基本原理 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬 液中细胞的含量成正比。 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞 的百分率。 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过 测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细 胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得 率。与分选速度成反比。 （二）分选的技术要求 参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参 数散点图 、二维等高图 、假三维等高 图 、三参数散点图 ） 设门分析技术 第二节第二节 数据的显示与分析数据的显示与分析 FSC：反映颗粒的大小 SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少 一、一、 参数参数 单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析 直分析方图 设门分析:REGION和GATE设置 二、数据显示方式二、数据显示方式 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的 颗粒数量的多少。 处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信 号值，而且具有相同的信号密度。 仅需要观察某个荧光强度的变化。既可用于 定性分析，又可用于定量分析 （一）单参数直方图 细胞相对数量 信道channel 单参数直方图 横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值，单位是道数，也可是线性的、对数的； 纵坐标表示细胞数。根据阴性对照设定适当的“门”（直线门），仪器就会给出测定 值（包括阳性细胞%和平均荧光强度）(单参数) 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测 量细胞的两个测量参数，根据这两个参数 就可以确定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号，最常用的 是点密图。在图中，每个点代表一个细胞 ，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧 光强度的颗粒数量的多少。 （二）双参数直方图 1、双参数直方图点图 绿色荧光强度 红色荧光强度 双参数直方图点图 A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞 2. 二维等高图 由类似地图上的等高线组成，其本质也是 双参数直方图。 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细 胞相对或绝对数，即“等高”。 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞 数愈多。 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。 二维等高图 3. 假三维等高图 是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方 法。它把原二维图中的隐座标细胞数同时显现，但参数维 图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和 “谷地”的结构和细节，有助于对数据进行分析。 （三）三参数直方图 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激 发光激发后，得到的荧光信号和散射光信 号可根据需要进行组合分析。 （四）流式细胞仪的多参数分析 Gate设置：指在某一张选定参数的直 方图上，根据该图的细胞群分布选定 其中想要分析的特定细胞群，并要求 该样本所有其他参数组合的直方图只 体现这群细胞的分布情况。 根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、 多边形门、任意形状门和十字门。 三、设门分析技术 A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞 A、B、C均 为任意门 线性门 Region设置: 区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相 关的概念，区阈可与门对应，但是也可以 包含于门。 D1 CD4+/CD3- D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3- D4 CD4- /CD3+ 十字门分析时，可以 由四个区域构成，即 G=D1+D2+D3+D4。 细胞亚群的数据分析 可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。 2011-9-13 在淋巴细胞亚群周围 设门，以单独分析或分 选该亚群细胞。 细胞亚群的数据分析 细胞亚群百分含量的方法 1、可以通过单参数直方图，二维点图和三 维图来分析结果。单参数直方图可定位边 界，二维点图可设置象限标志。如果需要 ，还可以建立数据统计表以输出结果。 2011-9-13 2011-9-13 直方图可直观单个参数的细胞数量。直方图可直观单个参数的细胞数量。 阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界。 左图左图 中中M1 M1 为阴性对照峰。右图中为阴性对照峰。右图中 M2 M2 为为 CD3 FITCCD3 FITC阳性峰。阳性峰。 统计结果表明，整个事件共记录了6000 个细胞，门内淋 巴细胞2891 个。其中 M1（阴性）细胞619 个，M2（ CD3 阳性）细胞 2272个细胞。淋巴细胞亚群CD3 阳性 百分含量的统计结果为：M2：2272/2891=78.59%。 2011-9-13 二维点图以双参数显示结果，每个点表示一 个或多个细胞。 2011-9-13 图图 5-6 5-6 为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为 四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左 下象限（下象限（LLLL）为双阴性细胞，左上象限（）为双阴性细胞，左上象限（ULUL）为）为Y Y轴阳性细胞轴阳性细胞 （CD19 PECD19 PE），左下象限（），左下象限（LRLR）为）为X X轴阳性细胞（轴阳性细胞（CD3 FITCCD3 FITC ） ，右上象限（，右上象限（URUR）为双阳性细胞（）为双阳性细胞（CD19+/CD3+CD19+/CD3+）。）。 淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+）的百 分含量为：296/2839=10.43%。 2011-9-13 细胞亚群百分含量的方法 2、设门：用不同形状的绘图工具定义所选区 域，然后统计该区域内指定细胞亚群的百分 含量。 2011-9-13 R4 R4 门内为门内为 CD4 CD4 阳性阳性 CD3 阴性的淋巴细胞亚群，其结果为： 40/2866=1.40%。 2011-9-13 样本制备 标记染色 液相芯片技术 质量控制 第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 外周血淋巴细胞样品的制备 分离单个核细胞 培养细胞的样品制备 蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤 单细胞悬液 一、免疫检测样品制备一、免疫检测样品制备 新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法 单细胞悬液的保存 深低温保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（2周） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月） 适用条件: 有较高的量子产额和消光系数 对488nm的激发光波长有较强的吸收 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性 二、常用的荧光染料与标记染色二、常用的荧光染料与标记染色 FITC Texas red PE.PC.APC PEcy5 FL1 FL2 FL3 FL4 激光 细 胞 悬 液 异硫氰酸荧光素 得州红 能量传递复合染料 藻胆蛋白类 （一）几种常见的荧光染料 名称染料激发 波长 荧光 颜色 溶解性对PH敏 感性 特点 异硫氰酸 荧光素 FITC488绿 525 易敏感易溶于水，与抗体 结合不影响特异性 得州红Texas red 568红 615 不易不敏感稳定，偶联后量子 产额低 藻红蛋白PE488橙 575 易不敏感具较多发光基团， 消光系数和量子产 额高 藻青蛋白PC488 别藻青蛋 白 APC633红 670 能量传递 复合染料 PEcy5488红 670 易不敏感减少交叉，成本高 常用的几类荧光染料 用化学法将两种不同激发波长的染料 结合在一起，在488nm激发光照射下，通过 一个荧光染料被激发后产生的发射波长再 激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检 测到该特定荧光信号。 能量传递复合染料 PE CY5 CY5 CY5 488nm 575nm 670nm 红色荧光 花青苷5 藻红蛋白 能量传递复合染料机制 荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合 免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体 组合标记 （二）免疫荧光标记（二）免疫荧光标记 2011-9-13 抗体标记的方法 2011-9-13 FCM标记方法 l单标： 一种单抗 : FL1, FSC, SSC（三参数） l双标： 两种单抗：FL1, FL1, FSC, SSC（四参数） l三标： 三种单抗：FL1,FL2, FL3,FSC, SSC（五参数） l四标： 四种单抗：FL1,FL2,FL3,FL4,FSC,SSC（六参数） 抗体的选择 首选直接标记抗体 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原 间接标记：适用范围广， biotin-avidin不适合弱 抗原的检测 实验对照的设计 空白对照：ALL 阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪 器校正） 阳性对照：检测阴性时 把微小的乳胶微球分别染成上百种不 同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微 球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒 进行特异性地结合，经激光照射后不同待 测物产生不同颜色，并可进行定量分析。 因检测速度极快，又称液相芯片技术。 三、免疫胶乳颗粒技术的应用 微小的乳胶微球分别染 成上百种不同的荧光色 （固相芯片是用探针在 芯片上的坐标位置给基 因特异性编码；液相芯 片则用颜色来编码） 通过对标记不同荧光素分子的检测，实 现FCM对可溶性物质的定量分析 适当的制备方式 处理红细胞 实体组织来源标本用机械法 温度2537，pH7.07.2 四、流式细胞免疫学技术的质量控制 （一）单细胞悬液制备的质控（一）单细胞悬液制备的质控 温度 pH 染料浓度 固定剂 （二）免疫荧光染色的质控（二）免疫荧光染色的质控 光路与流路校正: 确保激光光路与样品 流处于正交状态，减少变异（CV）。 PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测 时仪器处于最佳灵敏度工作状态。 绝对计数校准: 保证计数的准确性。 Flow-checkFlow-check Flow-setFlow-set Flow-countFlow-count （三）仪器操作的质控（三）仪器操作的质控 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照， 选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和 设置电压，以保证特异性。 全程质量控制：与待测标本一起标记和检测 ，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。 （四）免疫检测的质控（四）免疫检测的质控 流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫 学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用 流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记 分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫 的研究增加了有效的手段和帮助。 第四节 在免疫学检验中的应用 泛指所有参与免疫应答或与免疫应答有关的 细胞。各种免疫细胞均源于造血干细胞。 免疫细胞免疫细胞 T淋巴细胞 T淋巴细胞是在胸腺中分化成熟的淋巴细胞 ，故称胸腺依赖性淋巴细胞(Thymus- dependent lymphocyte),简称T细胞。 分布：在外周血中约占淋巴细胞总数的 65%75%，在胸导管内高达95%以上。 由T细胞介导的免疫称细胞介导免疫。 T细胞表面标志 T细胞抗原受体：成熟T细胞表面具有特异性识别抗 原并与之结合的分子结构，称T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)。TCR是一种双肽链分子，按肽链编 码基因不同可分为： TCR：95%的TCR分子，由链和链经二硫键 连接的异二聚体分子，也称TCR-2。T细胞特异性 免疫应答主要是这一类T细胞完成。 TCR：少数TCR分子由链和链组成的异二聚 体分子，称TCR-1。可直接识别抗原 。主存在于 小肠粘膜上皮和表皮，外周血中仅占T细胞的 0.5%10%。 T细胞分化抗原 1982年以来，国际有关专门会议把多数学者 所制备的多种白细胞表面抗原的单克隆抗体 进行了分类整理，并以分化群(cluster of differentiation CD)统一命名。应用分化群抗 体所鉴定的抗原，称为分化群抗原(CD抗原) 。 现在经命名了CD1CD166共180个分化抗原 群，其中CD4和CD8是区分成熟T细胞亚群 的主要表面标志。 T细胞的亚群及功能 一般按分化抗原和免疫功能的不同将T细胞分 为CD4+T细胞(CD4+、CD8-)和CD8+T细胞 (CD4-、CD8+)两个亚群； 按免疫功能不同将T细胞分为辅助性T细胞 (helper T cell,TH)、抑制性T细胞(suppressor T cell,Ts)、细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell,Tc或 CTL)和迟发型超敏反应性T细胞(delayed type hypersensitivity T lymphocyte,TDTH)。 也可按T细胞抗原识别受体不同分为TCRT 细胞和TCR两类。 B淋巴细胞 鸟类B淋巴细胞在法氏囊内发育成熟。哺乳动 物B淋巴细胞早期在卵黄囊、胚肝发育；从胚 胎发育后期至出生在骨髓内分化成熟，然后进 入外周淋巴器官。 当细胞同时表达IgM和IgD时，称成熟的B细胞 ，此时可以接受抗原的刺激。 由B细胞介导的免疫称体液免疫。每个B细胞 每小时约有1X107个抗体分子释放到细胞外， 其分泌的Ig可高达其合成蛋白质总量的30%。 B细胞表面标志 膜免疫球蛋白(membrane immunoglobulim, mIg)是B细胞最具特征性的表面标志，也是B 细胞抗原受体(BCR)。B细胞上的mIg与血清 中抗体的Ig结构相似，均由两条相同的重链(H 链)和两条相同的轻链(L链)构成。 在正常人外周血中多数B细胞可同时表达 mIgM和mIgD，且均为单体结构，少数B细胞 表面还可同时表达IgG、IgA或IgE分子。 NK细胞(natural killer cell，自然杀伤细胞) NK在外周血中约占淋巴细胞总数的15%，在 脾内约有3%4%，也可出现在肺脏、肝脏和 肠粘膜，在胸腺、淋巴结和胸导管中罕见。 NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，不需要预 先由抗原致敏，也不需要抗体参与。 NK细胞杀伤的靶细胞主要是肿瘤细胞、病 毒感染细胞、较大的病原体(如真菌和寄生虫) 、同种异体移植的器官、组织等。 T淋巴细胞及其亚群分析 Th-CD3+/CD4+/CD8- Tc-CD3+/CD4-/CD8+ B淋巴细胞及其亚群分析 B1(CD19+/CD5+):产生IgM型自身抗体, 参 与免疫调节、与自身免疫病的发生有关 B2(CD19+/CD5-):受外来抗原刺激, 产生高 亲和性特异性抗体 一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析 用CD3/CD19区分T和B淋巴细胞 CD3是T细胞特异性抗原，CD19可用来识别 B细胞。 CD3、CD19阳性表达为独立的阳性细胞群 。 CD3/CD19双染色时，只出现单阳性细胞。 用CD3/CD4鉴定CD4T淋巴细胞 先用CD3区分全部T细胞。CD3+/CD4+为辅 助或诱导性T细胞（HIV病毒感染对象） CD3-/CD4+细胞群由单核细胞组成。 CD3/CD4CD3/CD4抗体组合能将抗体组合能将CD4CD4阳性辅助阳性辅助/ /诱导诱导 性性T T细胞与细胞与CD4CD4阳性单核细胞分开。阳性单核细胞分开。 用CD3/CD8鉴定CD8+T淋巴细胞 CD8的表达不只限于T-细胞毒性/抵制细胞 ，在部分NK细胞上能检测到这种抗原。右 与CD3一起来鉴定T-细胞毒性/抵制细胞。 同时表达CD3/CD8的是CD8+T淋巴细胞 CD3-/CD8+-部分NK细胞和少数粒细胞 。该类细胞弱表达CD8+，由于缺少CD3， 易从CD3+/CD8+T细胞区别。 NK细胞 CD16（FcRIII)表达于大多NK细胞上，也 表达于中性粒细胞 CD56表达于多数NK细胞上，也表达于一些 T细胞上。与CD3联用可区分 CD3+/CD56+T细胞和CD3-/CD56+NK细胞 CD3/CD16/CD56联合使用可完全鉴定所有 NK细胞-CD3-/CD16+/CD56+ 细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例 ) 细胞内细胞因子测定 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统及白血病免疫分型三、淋巴造血系统及白血病免疫分型 对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型 用于选择化疗方案、判断预后及检出微小 残留病变 CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例 MDR(+)表示对化疗药物耐药 四、肿瘤耐药基因分析 五、五、AIDSAIDS病检测中的应