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4 p22phox在高糖所致的内皮细胞凋亡中的作用及机制在高糖所致的内皮细胞凋亡中的作用及机制 研究生：研究生： 盛顺良盛顺良 导导 师：师： 王王 佐佐 教教 授授 中文摘要 目目 的的 探讨p22phox 基因沉默在高浓度葡萄糖诱导的内皮细胞活性氧生成和 细胞凋亡中的作用及其机理。 方方 法法 用型胶原酶消化分离培养人脐静脉内皮细胞（huvecs） ，在倒置显 微镜下观察其形态。免疫组化法检测huvecs内第因子相关抗原的表达。将原 代培养的人脐静脉内皮细胞分为对照组、 高糖组、 高糖+sirna转染组和sirna 转 染组。采用western-blot检测p22phox和caspase-3蛋白的表达，流式细胞仪检测细 胞内活性氧水平及细胞凋亡率，hochest33342染色观察细胞的胞核形态，分光光 度计检测caspase-3酶活性。 结结 果果 分离得到的huvecs均表达第因子相关抗原；sirna能有效抑制 p22phox 表达；高葡萄糖能诱导p22phox 表达；与对照组相比，高糖组细胞 p22phox蛋白水平、活性氧水平、细胞凋亡率、caspase-3活性和蛋白水平均明显 增高（p 0.05） ；高糖+sirna 转染组的细胞p22phox蛋白水平、活性氧水平、 细胞凋亡率、caspase-3活性和蛋白水平均明显低于高糖组（p 0.05） 。 结结 论论 1.转染sirna-p22phox能抑制内皮细胞p22phox表达； 2.抑制p22phox表达能降低高糖所致的内皮细胞活性氧生成和细胞凋亡。 关键词关键词 动脉粥样硬化，人脐静脉内皮细胞， p22phox， 葡萄糖， 活性氧 5 本课题由以下基金项目资助 本课题受湖南自然科学基金本课题受湖南自然科学基金 (:30470720)； 中国中国博士后基金博士后基金(: 2005037157)； 湖南省自然科学基金湖南省自然科学基金(:06jj5058)； 湖南省教育厅课题湖南省教育厅课题(07c617)资助， 在此予以特别致谢。资助， 在此予以特别致谢。 6 the effects of p22phox on endothelial cell apoptosis induced by high-glucose and its mechanisms objectives: to study the effects of nad (p)h oxidase subunits p22phox on endothelial ros induction and cell apoptosis induced by high-glucose. methods：mophology of huvecs was observed by inverted microscope. expression of factor related antigen in huvecs was investigated by immunohistochemistry. huvecs were divided into four groups:control group,high glucose group , sirna group and high glucose+sirna group. expression of p22phox and caspase-3 were investigated by western-blot. intracellular ros level, and cell apoptosis rate in huvecs were detected by flow cytometry. hochest33342 fluorescent dying was used to detect cell apoptosis. activity of caspase 3 was detected by fluoremetry. results ：the huvecs were detached successfully. p22phox-sirna could induce nad(p)h oxidase subunit p22phox gene silence.high glucose could induce p22phox expression. compared with control group, p22phox expression ， ros level ，cell apoptosis rate，caspase 3 activity and caspase-3 expression was significantly increased in high glucose group（p 0.05）. but p22phox expression ，ros level ，cell apoptosis rate，caspase 3 activity and caspase-3 expression in high glucose+sirna group significantly decreased （p 0.05） compared with high glucose group（p 0.05）. conclusions：transfection with sirna-p22phox could effectively inhibit 7 p22phox expression in huvecs.inhibiting p22phox expression could decrease ros level and cell apoptosis induced by high-glucose. key words: atherosclerosis, p22phox, human umbilical vein endothelial cells, glucose, reactive oxygen species postgraduate：sheng shun-liang (pathology tbst洗膜，室温振摇3次每次5分钟;加入 1:3000稀释的辣根过氧化物酶标记的相应二抗，与膜共同孵育1小时，室温振摇； ttbs洗膜，室温振摇，5次每次5分钟。dab染色或 于暗室中等体积混合ecl发光缓冲液a与b并均匀滴加到pvdf膜的蛋白面上， 压 x-ray胶片3-10min；显影，定影。 1.10 流式细胞仪检测流式细胞仪检测各组各组细胞内活性氧水平细胞内活性氧水平 15 以dcfh-da作为荧光探针对细胞内活性氧进行荧光标记，用流式细胞仪检测 每组细胞内的荧光强度。未加dcfh-da的阴性对照组的自发荧光值定为1，而其 它各组的荧光值均为相对阴性对照来说的相对值（各组的荧光强度/阴性对照的 荧光强度） 。 将处理好的huvecs细胞用无血清培养基冲洗细胞2次； 加5ml无血清培养基和7l dcfh-da到25cm2的培养瓶中，在37含5% co2 的培养箱中孵育45min； pbs洗3次，用胰酶消化，加血清终止反应，用无血清培养基洗2次，用3ml 无血清培养基重悬细胞； 其中阳性对照组加阳性药物rosup（试剂盒提供）5l，常温下孵育1h； pbs冲洗2次后用流式细胞仪检测细胞内活性氧。 1.11 流式细胞仪检测流式细胞仪检测各组各组细胞凋亡率细胞凋亡率 收集各组细胞，pbs洗涤细胞1次，用70%的乙醇5ml固定细胞过夜； 800转/min离心5min，pbs洗涤细胞2次； 加入含rnase a的pbs 500l(终浓度50g/ml)，37水浴孵育30min；加入 碘化丙啶，使其终浓度为50g/ml； 4避光30min，300目尼龙网过滤； 上流式细胞仪检测，计数10000个细胞，测定凋亡细胞的数量。 1.12 实验结果的统计学处理实验结果的统计学处理 所有数据均用均数标准差表示，用spss13.0进行统计处理，统计学采用t 检验，以p0.05判定有统计学意义。 2 实验结果实验结果 16 2.1 原代人脐静脉内皮细胞鉴定原代人脐静脉内皮细胞鉴定 倒置显微镜下可见huvecs贴壁生长呈鹅卵石样排列（见图1a）；内皮细胞 因子相关抗原是内皮细胞所特有，用免疫组化法检测到分离培养的huvecs 因子相关抗原为阳性，胞内可见棕色颗粒，而未加一抗（用pbs代替一抗）的 阴性对照组huvecs胞内无棕色颗粒（见图1b和图1c）。结果证实了我们从人 脐静脉分离得到的细胞是内皮细胞。 2.2 转染转染p22phox-sirna 对内皮细胞对内皮细胞 p22phox 表达的影响表达的影响 图图 1 1 人脐静脉内皮细胞的鉴定人脐静脉内皮细胞的鉴定（1010） a：倒置显微镜下可见huvecs贴壁生长呈鹅卵石样排列 b： 免疫组化法检测阴性对照组 （用pbs代替一抗） huvecs中的因子相关抗原的表达： 胞内未见棕色颗粒 c：免疫组化法检测huvecs中因子相关抗原的表达呈阳性：胞内均可见棕色颗粒 a a b b c c 17 western-blot检测p22phox蛋白表达结果显示（图2和表1）：与对照组比较, p22phox蛋白表达在高糖组显著增高, 在sirna 组显著减低(p0.05)；高糖加 sirna 组p22phox蛋白表达显著低于高糖组(p0.05)。 2.2 抑制抑制p22phox表达表达对高糖诱导的内皮细胞内活性氧生成的影响对高糖诱导的内皮细胞内活性氧生成的影响 图图 2 转染转染p22phox-sirna 对内皮细胞对内皮细胞 p22phoxp22phox 蛋白表达的抑制作用蛋白表达的抑制作用 1 对照组，2 高糖组，3 高糖+sirna 组，4 sirna 组 p22phox（22kda） -actin（42kda） 1 2 3 4 分组 p22phox/-actin 蛋白的相对值 对照组 0.48 0.12 高糖组 0.69 0.2a 高糖加 sirna 转染组 0.22 0.06b sirna 转染组 0.16 0.04a 表表 1 1 转染转染p22phox-sirna 对内皮细胞对内皮细胞 p22phoxp22phox 蛋白表达的抑制作用蛋白表达的抑制作用 x a 为与对照组比较，p0.05 ；b 为与高糖组比较，p0.05 18 与其余3 组比较, 高糖组细胞内活性氧含量显著增高，说明高糖能诱导内皮 细胞活性氧产生；与高糖组相比，高糖加sirna 转染组因p22phox表达受到抑制 而活性氧生成明显减少（p0.05）； sirna 转染组活性氧水平与对照组相比差 异无统计学意义(图3)。 2.3 抑制抑制p22phox表达表达对高糖诱导的细胞凋亡的影响对高糖诱导的细胞凋亡的影响 a d c e f b 图图 3 3 抑制抑制p22phoxp22phox表达对人脐静脉内皮细胞内表达对人脐静脉内皮细胞内rosros生成的影响生成的影响 以dcfh-da为荧光探针对细胞内ros进行荧光标记，用流式细胞仪检测细 胞内荧光强度，横坐标为荧光强度，纵坐标为同一荧光强度下的细胞数 a 阴性对照组 （未加dcfh-da） （1） b 阳性对照组：加阳性药物rosup在常温下培养1小时（加dcfh-da） （52.16.7） c 对照组 （加dcfh-da） （2.80.9） d 高糖组（加dcfh-da） （8.32.4） a e 高糖加sirna 转染组（加dcfh-da） （3.51.0） b f sirna 转染组（加dcfh-da） （3.00.9） a：p0.05，与对照组相比较；b：p0.05，与高糖组比较 19 流式细胞仪检测结果显示（图4），高糖组细胞内活性氧含量增加的同时细 胞凋亡率也明显增加（p0.05），说明高糖可能通过诱导内皮细胞活性氧产生而 增加细胞凋亡；而抑制p22phox表达后可明显抑制由高糖诱导的细胞凋亡 （p0.05）； sirna 转染组的细胞凋亡率与对照组相比无统计学意义。 hochest染色结果（图5）可以看出，对照组和sirna 转染组的细胞胞核形态 完整未出现染色质浓缩、 边缘化， 高糖组可见部分胞核出现染色质浓缩、 边缘化， sirna sirna 转染组转染组 对照组对照组 高糖高糖加加 sirna sirna 转染组转染组 高糖组高糖组 图图 4 4 抑制抑制p22phoxp22phox表达对人脐静脉内皮细胞表达对人脐静脉内皮细胞凋亡率的影响凋亡率的影响 对照组（5.51.3）% 高糖组（23.84.5）% a 高糖加sirna 转染组（15.93.2）% b sirna 转染组（5.21.0）% a：p0.05，与对照组相比较；b：p0.05，与高糖组比较 20 而高糖加sirna 转染组出现染色质浓缩、边缘化的胞核较高糖组明显减少。 2.4 抑制抑制p22phox表达表达对对caspase-3的影响的影响 高糖组高糖组 sirna sirna 转染组转染组 对照组对照组 高糖加高糖加 sirna sirna 转染组转染组 图图 5 hochest 染色观察抑制染色观察抑制 p22phox 表达对人脐静脉内皮细胞的胞核表达对人脐静脉内皮细胞的胞核形态形态 对照组：胞核形态完整未见染色质浓缩、边缘化 高糖组：部分胞核出现染色质浓缩、边缘化（如 所示） 高糖加 sirna 转染组：出现染色质浓缩、边缘化（如 所示）的胞核较高糖组明显减少 sirna 转染组：胞核形态完整未见染色质浓缩、边缘化 21 caspase 活性定量检测结果显示，高糖组的 caspase-3 活性较对照组明显升 高，有统计学意义（p0.05），说明高糖可能通过活化 caspase-3 而诱导细胞凋 亡；与高糖组相比，高糖加 sirna 转染组因 p22phox 表达受到抑制，caspase-3 活性也明显受到抑制（p0.05）; sirna 转染组和对照组的 caspase-3 活性均较 低。 western-blot分析显示，对照组与sirna 转染组caspase-3均以无活性的前体 形式存在；而高糖组细胞经高浓度葡萄糖（20 mmol/l的葡萄糖）持续刺激72 h 后，即可见caspase3前体的裂解片段（p11） ，表明caspase-3已经被活化；高糖加 sirna 转染组因p22phox表达受到抑制caspase3的活化明显受到抑制（图7） 。 图6 抑制p22phox表达对caspase-3活性的影响 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 对照组高糖组高糖加sirna 转染组 sirna 转染组 caspase-3活性相对值 a b a：p0.05，与对照组相比较； b：p0.05，与高糖组比较 对照组 高糖组 高糖加 sirna 转染组 sirna 转染组 p11（裂解片段） procaspase-3 22 讨讨 论论 糖尿病是心血管疾病的重要危险因素， 其中血糖异常是糖尿病人血管并发症 23 的重要原因之一，在高糖下内皮细胞发生特异的功能异常和形态改变，是血管并 发症的早期标志。体外研究表明，高糖具有一定的细胞毒性，可延长内皮细胞的 增殖，破坏细胞周期，增加 dna 损害，加速细胞凋亡。高糖培养的内皮细胞还 可出现细胞自由基清除功能受损。此外，高糖还可调节粘附分子的表达并增加中 性白细胞和单核细胞对内皮细胞的粘附，加重内皮细胞的损伤4，5。在高水平 葡萄糖状态下，内皮细胞功能失调，主要原因有：氧化应激增强，氧自由基生 成增多； no 活性降低； pgi2 功能缺陷； 内皮细胞凋亡； 激发炎症反应。 降低细胞内 ros 的水平是保护内皮细胞功能完整性及防治糖尿病并发动脉粥样 硬化的关键途径之一12。因此。保护内皮细胞免受损伤是控制糖尿病血管并发 症的关键因素。 用葡萄糖处理内皮细胞，可以检测到ros水平升高，细胞处于高氧化应激状 态。葡萄糖诱导ros的产生与其本身的代谢有关，而不是由于细胞外高渗状态刺 激引起的。 因为只有d-葡萄糖能够引起ros的升高而l-葡萄糖及可以造成高渗状 态的甘露醇都没有这种效应；如果添加抑制葡萄糖摄取的药物，则可以有效抑制 ros的升高 14。在葡萄糖的作用下，ros的产生途径有线粒体呼吸链、nos失 偶联和nadph氧化酶等， 但nadph氧化酶被认为是内皮系统中最主要的ros来 源。nox主要包括五个组分:p47phox, p67phox, p22phox，rac1以及gp91phox。 p22phox和gp91phox为膜蛋白,在中性粒细胞分泌小泡或特异的颗粒膜表面形成 异源二聚体, 即细胞色素b558。nadph的电子就是通过它的两种辅基由黄素蛋 白fad经血红素转移到o2上的。 p47phox和p67phox通常以复合物的形式存在于中 性粒细胞的胞质内, 它们均含有sh3结构域, 此外, 在p67phox的n末端及 p47phox的c末端还另有富含脯氨酸的sh3结合结构域。 当中性粒细胞处于静息状 态时, p47phox自身的两个sh3结构域相互结合使其无法转移至膜与细胞色素 b558作用。细胞激活后, p47phox的c末端sh3结构域与p67phox的c末端sh3结构 域结合从而将其自身的sh3结构域释放出来。释放出的sh3结构域既可在胞质内 和p67phox的n末端sh3结合结构域作用, 又可转移到膜上和p22phox结合，在rac 的参与下激活nox而启动呼吸链，爆发级联反应。进而推测,nox的激活很可能 伴随着胞质复合物的重新排列15 21。 p22phox 是 nad(p)h 氧化酶活性必需亚单位。p22phox 亚单位由基因座 24 cyba 编码，位于染色体 16q24，有大约 600bp 的开放阅读框，由 6 个外显子所 编码，长约 8.5kb，有 5 个内含子。p22phox 基因多态性共有 10 种，其中 c242t 多态性发生于第 4 外显子，第 72 位组氨酸被酪氨酸取代产生 rsa的酶切位点。 p22phox 在 72 和 94 位的组氨酸残基是血红蛋白的结合位点，与 nox 的功能密 切相关22。据报道，在日本人群中，p22phox c242t 的多态性影响 ldl 颗粒的 大小及胰岛素抵抗，与糖尿病及动脉粥样硬化的发生密切相关23。weiding p 等 24用 22mm 葡萄糖处理冠状动脉血管内皮细胞 7 天，观察到还原型谷胱甘肽减 少 50%并检测到 p22phox 的表达上调； christ m 等25用高浓度葡萄糖处理猪的冠 状动脉，avogaro a 等 26在糖尿病患者血液中分离出的单个核细胞中都观察到 p22phox 的表达上调。2004 年 talija 等人发现提高内皮细胞 p22phox 的表达能使 细胞内 ros 显著增加27；许多研究也证实在血管平滑肌细胞中加入 pdgf 和 tnf-等均能上调 p22phox mrna 的表达并导致 ros 的生成；而在内皮细胞中 加入 ang也能上调 p22phox mrna 的表达，导致 ros 的水平升高28 30。 rnai 目前已经成为研究基因功能和信号通路的不可缺少的工具, 是一种 可快速高效获得基因功能缺失的有效方式。rnai 是涉及多种蛋白的复杂过程, 双链 rna 进入细胞后经 dicer 酶作用生成长度为 2l23 nt 的双链 sirna(short interference rna), 而 sirna 能精确识别位于外显子区域的互补靶序列,通过其 反义链和靶 mrna 共同组成 risc ,导致靶序列的降解。因此 rnai 是通过诱导 mrna 序列特异性降解引起转录后基因沉默, 一般认为, rnai 适用于所有的物 种。大量研究证实, 体外合成的 sirna 在低等生物和高等生物的细胞中均能发 挥强大的特异性基因抑制功能31 ，32, 对非靶基因的表达无影响, 是一种高效特异 性抑制基因表达的新途径。 李虹等13最近研究发现 sirna 靶向沉默 p22phox 表 达能抑制由血管紧张素(ang)诱导的 ecv-304 内皮细胞 ros 生成。 这些研究 提示 p22phox 可能参与了血管细胞 ros 的生成，但高浓度葡萄糖糖诱导人脐静 脉内皮细胞凋亡的机理仍然不清楚。 本研究用原代分离得到的人脐静脉内皮细胞 为模型，采用 rnai 技术抑制 p22phox 表达，以观察 p22phox 在高浓度葡萄糖糖 所致的内皮细胞 ros 生成和细胞凋亡的影响，结果发现转染 p22phox 后能有效 地抑制 p22phox 表达（p0.05） ，且抑制 p22phox 表达后能显著降低高浓度葡萄 糖糖所致的内皮细胞 ros 生成（高糖加 sirna 转染组与高糖组比较，p0.05） 25 和细胞凋亡率（高糖加 sirna 转染组与高糖组比较，p0.05）,这提示高糖可能 部分通过激活nadph 氧化酶亚单位p22phox 使ros 生成增加而诱导细胞凋亡。 进一步研究发现，人脐静脉内皮细胞经高浓度葡萄糖处理后 caspase-3 活性明显 增高且可见 caspase3 前体的裂解片段 （p11）（图 7） ， 这表明高糖能诱导 caspase-3 活化，但是在高糖加 sirna 转染组 caspase-3 活化明显受到抑制。因此高糖诱导 人脐静脉内皮细胞 caspase-3 的活化与 p22phox 表达有关。我们以前研究发现高 浓度葡萄糖糖能诱导 nadph 氧化酶 nox4 表达升高33。因此，在高浓度葡萄 糖糖刺激人脐静脉内皮细胞时，nox4 和 p22phox 是否存在相互作用，nox4 和 p22phox 是否协同参与了细胞内 ros 生成，是否还有 nadph 氧化酶的亚单位 参与 ros 生成， 过多的 ros 是否是高浓度葡萄糖糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡 的直接原因，这些问题都有待于下一步研究证实。 26 结结 论论 1.转染sirna-p22phox能抑制内皮细胞p22phox表达； 2.抑制p22phox表达能降低高糖所致的内皮细胞活性氧生成 和细胞凋亡。 27 参考文献参考文献 1. jian-mei l,nick pg,david jg,et al. activation of nadph oxidase during progression of cardiac hypertrophy to failure. hypertension .2002,40:477-484 2. lusis aj.atherosclerosis.nature.2000,407:233-241 3. a. risso,f. mercuri,l. quagliaro,g，et al. intermittent high glucose enhances apoptosis in human umbilical vein endothelial cells in culture am j physiol endocrinol metab. 2001，281: e924e930 4. oh cj, kil is, park ci, et al. ursolic acid regulates high glucose-induced apoptosis.free radic res. 2007 ，41(6):638-44 5. ceriello a, quagliaro l, damico m, et al. acute hyperglycemia induces nitrotyrosine formation and apoptosis in 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附附 录录 （主要英文缩略语索引） as atherosclerosis 动脉粥样硬化 bp base pair 碱基对 pbs phosphate buffer solution 磷酸盐缓冲液 rpm revolution per minute 每分钟转速 huvec human umbilical vein endothelial cells 人脐静脉内皮细胞 edta ethylenediamine etracetic acid 乙二胺四乙酸 fitc fluorescence-isothio c panate 异硫氰酸荧光素c dcfh-da 2，7 dichlorofluorescin diacetate 二氯荧光黄双乙酸盐 cdna complementary dna 互补脱氧核糖核酸 dntp deoxynucleotide triphosphate 脱氧核苷三磷酸 ros reactive oxygen species 活性氧 nadph nicotinamide adenine dinucleotide 尼克酰胺腺嘌呤二核 phosphate 苷酸磷酸 pkc protein kinase c 蛋白激酶c 32 文文 献献 综综 述述 nadph 氧化酶在高糖所致内皮细胞氧化应激中的作用氧化酶在高糖所致内皮细胞氧化应激中的作用 盛顺良盛顺良 综述综述 王佐王佐审阅审阅 关键词关键词 nadph 氧化酶 高糖 内皮细胞 氧化应激 摘摘 要要糖尿病是动脉粥样硬化的独立危险因素，内皮细胞损伤是动脉粥样硬化 的始动因素，内皮细胞内有很多酶参与了活性氧的生成。研究发现在葡萄糖诱导 的内皮细胞氧化应激中，nadph 氧化酶可能起重要作用。本文主要就 nadph 氧化酶的结构特性及其在高糖所致内皮细胞氧化应激中的作用及相关的信号通 路作简要概述。 糖尿病的主要特点是血糖高水平，它可以诱导血管内皮细胞凋亡、促进平滑 肌细胞增殖、单核巨噬细胞浸润，从而启动as。糖尿病是心血管疾病重要危险 因素， 其中血糖异常是糖尿病人血管并发症的重要原因之一，在高糖下内皮细胞 发生特异的功能异常和形态改变，是血管并发症的早期标志。糖尿病患者的血浆 中as的预测因子升高，危险性增加1。糖尿病患者血浆脂质氧化修饰增强，且糖 尿病与高脂血症对于as有协同作用，餐后高糖也能通过氧化应激单独作用或者 与餐后高甘油三酯血症协同作用导致内皮功能失调2。此外，葡萄糖的代谢产物 -糖基化终末产物也可以导致钙粘蛋白减少、渗透性增加、内皮迁移增加，内皮 屏障减弱3。barmgartneparzer4等最先在人脐静脉内皮细胞(huvecs)中证实了 高糖能促进内皮细胞凋亡， 凋亡引起的细胞死亡调节可能是血管结构异常和损伤 形成的决定因素之一。核因子-b(nf-b)、丝裂原活化蛋白激酶（mapk）信 号通路在细胞凋亡中的作用已逐渐被认识。本文主要就nadph氧化酶的结构特 性及其在高糖所致内皮细胞氧化应激中的作用及相关的信号通路作简要概述。 1. nadph 氧化酶的生物学特性氧化酶的生物学特性 nadph氧化酶由5 个亚基组成: 2 个膜亚基gp91phox和p22phox,两者构成 一个膜复合体细胞色素 b558; 3 个胞质亚基 p47phox、p40pox、p67phox。另外, 33 还有 2 个低分子量的 gtp 结合蛋白 rac1 和 rac25。phox 的晶体结构显示， p47phox 的两个前后排列的 src 同源区相互作用能抑制其与 p22phox 结合。当 p47phox 被磷酸化时这种抑制作用消失，胞质侧的亚组分易位到胞膜与细胞色素 b558 结合，且在 rac 的参与下激活 nadph 氧化酶而启动呼吸链，爆发级联反应 6。最近又发现在非吞噬型细胞如血管平滑肌细胞、内皮细胞、动脉外膜细胞、 成纤维细胞、心肌细胞、上皮细胞和脂肪细胞等也表达 nadph 氧化酶的所有亚 组分7,8， 其中 p22phox 在各种细胞中都高表达， gp91phox 主要在单核细胞表达， 而在内皮细胞、smcs 和成纤维细胞中表达甚低9。血管细胞 nadph 氧化酶与 吞噬型细胞 nadph 氧化酶存在一些区别:血管细胞 nadph 氧化酶常以 nadph 或 nadh 为电子供体，而吞噬型细胞氧化酶仅以 nadph 为电子供体； 无刺激时血管细胞 nadph 氧化酶也持续产生低水平的 o2 _，在某些病理刺激 下 o2 _的水平能被上调，但其 o2 _生成量仍远低于激活的嗜中性粒细胞所产生的 o2 _，这可能是由于血管细胞 nadph 氧化酶的表达量低于嗜中性粒细胞。uwe 等10发现在人脐静脉内皮细胞和白细胞中 p47phox 和 p22phox 的表达无明显差 别， 而 huvecs 中 p67phox 和 gp91phox 的表达却远低于白细胞 （其中 gp91phox 的表达仅为白细胞的 1%） ； 在未受刺激的内皮细胞中大部分 nadph 氧化酶亚 组分在胞内表达，且功能性 nadph 氧化酶亚组分与胞内的细胞骨架（细胞色素 b558）相连处于组装前状态，这种状态能使 nadph 氧化酶维持较低的活性而持 续产生低水平的 o2 _；血管细胞 nadph 氧化酶产生的 o2 _大部分在细胞内， 而吞噬型细胞 nadph 氧化酶产生的 o2 _ 却在胞外11。 近年发现了两种新的 gp91phox 同工酶家族即 nox（nadph oxidase）和 duox（dual oxidase） 。现已发现的 nox 家族有 nox1、nox2（gp91phox） 、 nox3、nox4、nox5 等成员12。nox1 基因又名 mox1 （mitogenic oxidase） 或 noh1（nadph oxidase homologue） ，它位于 x 染色体上。 nox1 至少有三 种剪切变构体 （splice variants） ， 即 nox1 （外显子 1-13） 、 nox1 （外显子 1-10， 12，13） 、nox1（外显子 1-5，14） 。nox1 主要在结肠表达13，前列腺、子宫 和 vsmcs 也有少量表达，视网膜的外细胞中也有微弱的表达14；nox2 即 gp91