结核与耐药结核快速诊断技术课件

结核及耐药结核自动化检测技术 2 Cepheid 我国结核现状 结核诊断新技术 2015 WHO结核诊断指南更新 2014年全球结核发病率 来源：WHO 2015年工作报告 2014年中国新发病例：826155 2014年中国结核发病率：68/100 000 近几年我国结核发病率逐年下降，但仍然属于结核高负担国家 2014年全球耐药结核发病率 来源：WHO 2015年工作报告 新发结核病例中的耐药结核比例 WHO估算2014年中国耐药结核发病数 新发病例：43000 复发病例：8200 我国属于耐药结核 高负担国家 高负担国家的耐药结核发现 我国当前耐药结核防控的问题： 不充分的耐药病人发现，不充足的耐药病人治疗 5.56% 纳入治疗 结核诊治出现偏差！ n过多依赖X-光片或其他影像学检查，忽略了以痰标本为基础的微生物 诊断 n过多依赖未经验证、或不能作为诊断依据的测试，比如血清学检查 n只参考传统的微生物检测结果 因为这些检测的不可靠性，WHO 不得不采取非常规手段，特别提出反 对这些测试的建议 全球结核控制不理想的问题出在哪里？ 可诊断活动期结核感染 无法区分活动期结核与潜伏期结核 传统技术现代技术 影像学涂片镜检培养皮肤菌素试验IGRA分子诊断 结核诊断的常见技术 n依据抗酸染色为基础的结核初筛的不可靠性 敏感性为50% 结核/非结核分枝杆菌不能区分（NTM可能占到40%） n以培养为基础的结核确诊和药敏对治疗的影响 2个月才获得药敏结果，导致患者脱落 2个月后调整治疗方案，导致耐药患者的漏诊和传播 n无法更早确诊耐药结核患者 当前临床诊治的难点 9 Cepheid 我国结核诊断现状 结核诊断新技术 2015 WHO结核诊断指南更新 结核诊断新技术 IGRA T-Spot QuantiFeron NAAT技术 等温扩增检测技术 线性探针 基因芯片 熔解曲线 巢式PCR 血清学检测 IGRA 原理：机体感染过结核分枝杆菌，T-淋巴细胞会在再次接触结核分枝杆菌时，产生和分泌特异性的细胞因子IFN- 操作步骤： 1.反转10次混匀 2.37C条件下孵育16-24小时 3.2000-3000g离心15分钟 4.用移液管取血浆 5.每个孔内放50ul结合液 6.加入50ul血浆，室温孵育120分钟 7. 洗板至少6次 8.每个孔内加100ul底物，室温孵育 30分钟 9.加入50ul反应终止液 10. 450nm波长下读取吸光度 11. 使用专用软件计算结果 操作步骤： 1.密度梯度离心分离外周血单个核 细胞（PBMCs） 2.洗涤PBMCs 3.将PBMCs与特异抗原一同加入到 预包被抗-干扰素抗体的培养孔 4.37C孵育16-20小时 5. 洗涤培养孔 6.加标记二抗 7. 孵育1小时 8. 洗涤培养孔 9.加显色液 10. 用蒸馏水终止反应 11. 用肉眼判断结果 QuantiFERON-TBT-SPOT.TB 采血量： 132月）的儿童阳性率更高 Xpert MTB/RIF: 灵敏度 62.5% (25, 91), 特异性 99.1% (98, 99.9) 涂片: 灵敏度 33% (8, 7)，特异性99.5% (98, 99.9) Xpert 检测儿童痰液，明显优于涂片；检测粪便标本性能同样优异 痰 液 粪 便 易于使用的样本处理器 (0.6g, 1.2g, 拭子) 粪便（0.6 g）的性能和呼吸 道标本效果相当，且非侵入 式样本更适合儿童 快速、即时的分子诊断实现检测就治疗 韩国，国立首尔大学医学院 2011年1月-2013年5月 681例患者 Xpert MTB/RIF可将从接诊到开 始抗结核治疗的平均时间从21天 缩短为6天 南非全国使用Xpert逐步替代涂片，耐药结核负担明显下降 2016 CATA, 南非NHLS优先项目负责人Wendy Stevens教授分享南非经验 南非在矿区及矿区周边社区使用Xpert对重点人群进行筛查 南非用Xpert检测肺外结核经验 (约翰内斯堡研究，n=1175) Xpert 检出率是260/1175，与液体培养 相当 277/1175 Xpert 灵敏度59% (CI 53, 65) ，特异性92% (CI 90, 94). 脓、抽吸物的的灵敏度最高，然后是(腹水，然后是胸水). 浓稠样本的灵敏度最高87% (CI 76, 94)，清液样本灵敏度较 低 48% (CI 36, 61). 痕量血液不影响检测性能 52% (CI 44, 60) ，离心也不影响 检测性能57% (CI 28, 82) Xpert 相比液体培养（10.5%污染），不容易受污染 影响，同时可更早获得利福平耐药结果. Xpert检测脓和抽吸物的特异性低于呼吸道样本，但这 些都是真阳性 样本类型WHO 报 告灵敏度 淋巴结组织 和抽吸物 85% CSF80% 胸水44% 胃液84% 其他组织81% 未来：Xpert Ultra 替代培养 Xpert MTB/RIF 痰液的检测下限为50-165 CFU/ml，2小时出结果 检测靶标：rpoB基因，5个探针检测突变，25 ul DNA用于PCR反应 涂阴标本的灵敏度60-80% 替代涂片的策略 Xpert Ultra 痰液检测下限为 5-25 CFU/ml 新的样本处理试剂盒（50ul DNA用于PCR反应） 检测靶标：IS16110、IS1081和ropB基因片段4个探针检测突变 优化的试剂盒流体技术和PCR循环（熔解曲线） 70分钟出结果 替代培养的策略 野生型 FIND基金和约翰内斯堡的医疗机构合作，10个国家进行多中心评估 34 Cepheid 我国结核诊断现状 结核诊断新技术 2015 WHO结核诊断指南更新 WHO 2015 结核诊断策略执行框架 分子诊断 Xpert MTB/RIF：WHO推荐可检测成人和儿童的痰液、痰沉淀、部分肺外结核标本； 检测利福平耐药的灵敏度为95% 线性探针：WHO推荐其可用于检测利福平耐药相关基因突变，以及氟喹诺酮耐药检测 ；检测异烟肼耐药的灵敏度低于培养（约85%） 潜伏性结核诊断 无金标准 WHO推荐中-高收入国家可采用IGRA，不建议低收入国家用IGRA替代皮肤菌素试验 WHO不建议血清学检测进行肺结核、肺外结核诊断 IGRA不应用于活动性结核诊断 WHO 2015 结核诊断策略执行框架 参比 实验室 区域/地级实验室 基层实验室 患者发现、治疗、随访及监测 ，开发并提供参考方法和标准 ，管理各级实验室 患者发现、治 疗、随访 筛查，患者发 现、转诊和治疗 涂片镜检、 Xpert MTB/RIF 涂片镜检、Xpert MTB/RIF、 条件允许时用固体培养和线性 探针检测涂阳痰液 涂片镜检、Xpert MTB/RIF、