第八章 治疗性抗体（cure antibody 生物制品学 教学课件

第九章 治疗性抗体（Cure Antibody ） 第一节 概述 (Section I Introduction) 1890年Behring和北里柴三郎发现了可特异中和外毒 素的血清组合白喉抗毒素，建立了血清疗法，开抗 体制药之先河。 至今，以破伤风抗毒素血清为首紧急预防和治疗以 毒血症为主要发病机制的疾病的有利武器。 抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。 血清中存在一种能特异中和外毒素的组分称之为抗 毒素。将血清中这种具有特异性反应的组分称为抗 体。 一、抗体分子的基本结构（Structure of Antibody） 抗体指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能 的球蛋白。 它是机体免疫系统受抗原物质刺激后，B淋巴细 胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成 和分泌的球蛋白。 具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白， 统称为免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）。 二、抗体分子的生物学功能（Biological function of Ab） 抗体是体液免疫应答中发挥免疫功能最主要的免疫 分子，其功能是由其分子中不同功能区的特点所决 定的。 u轻链（Light chain）上有一个轻链易变区（ Variable region of light chain，VL）及一个轻 链恒定区（Constant region of light chain ， CL）。 u重链（Heavy chain）有一个重链易变区（ Variable region of heavy chain，VH）及3-4个 重链恒定区（CH1-CH4）。 u抗体分子的各种功能区分别发挥不同的生物学效应 。 Fab与Ag结合 Papain Fab2 Fc 木瓜E Pepsin F(ab) 2 pFc 胃蛋白酶 Fc Fc通过胎盘与 补体及Fc受体c结合, 并是可结晶的片段 N端 C端 铰链区 IgG分子的结构模式图 CDR (互补决定区） 1. 特异性地结合抗原(Specific combine Ag) 是由V区（尤其是V区中的超变区）的空间构型决定 的，是可逆的，并受到pH、温度和电解质浓度的影 响。 aa极大变化的超变区（Hypervariable region， HV）或互补决定区（Complementarity determining region，CDR），CDR1CDR3 （各516aa）：可特 异性结合Ag； 框架区（Framework region，FR）：为片层结 构，aa序列相对稳定，不与Ag直接结合。 2. 活化补体(Activate complement) IgM 、IgG1、 IgG2和IgG3 可通过经 典途径活化补体。凝聚的IgA、 IgG4和 IgE等可通过替代途径活化补体。 3. 结合Fc受体 (Combined Fc receptor) 不同细胞表面具有不同Ig的Fc受体，分别用 FcR、 FcR等表示。当抗体与相应抗原结合 后，由于构型的改变，其Fc段可与具有相应受 体的细胞结合，发挥不同的生物学作用： （1）介导型变态反应 IgE与嗜碱性粒细胞、肥大细胞表面IgE高亲 和力受体FcRI结合，发生脱颗粒，引起型 变态反应。 （2）调理吞噬作用 抗体在抗原颗粒与吞噬细胞之间“搭桥”， 加强了吞噬细胞的吞噬作用； 抗体与相应颗粒性抗原接合后，改变抗原表 面电荷，降低吞噬细胞与抗原之间的静电斥力； 抗体可中和某些细菌表面的抗吞噬物质； 吞噬细胞FcR结合抗原抗体复合物后，吞噬细 胞可被活化。 （3）发挥抗体依赖的细胞介导的细 胞毒作用（ADCC作用） 当IgG抗体与带有相应抗原靶细胞结 合后，可与嗜中性粒C、单核C、巨嗜C、 NKC等效应C结合，发挥ADCC作用。 4. 通过胎盘(Through placenta) 在人类，IgG是唯一可通过胎盘 从母体转移给胎儿的Ig，是一种重要 的自然被动免疫，对于新生儿抗感染 有重要作用。 三、抗体分子的治疗作用（Cure effect of Ab） 各种抗体被广泛地应用于疾病的的诊断、预防及 治疗：1、在体外诊断上，用于检测各种抗原，包括感 染性病原体抗原、血清肿瘤可溶性抗原、细胞表面抗 原、受体、激素、神经递质、细胞因子等。 2、在肿瘤检测方面，同位素标记的单克隆抗体 可与肿瘤组织表面的抗原结合，起到免疫扫描、免疫 成像的作用，优于超声波和核磁共振。 3、在预防方面，抗体主要可用于感染性疾病的 预防，如流感、乙肝等。 1. 抗体的治疗机制（Cure mechanism of Ab） （1）中和作用(Neutrilization) 用于感染性疾病，使病原体或其产生 的毒素丧失致病力。 （2）示踪或导向作用（Tracer or targeted effect） 使与其相连的功能性分子特异性地激 活或封闭、破坏靶细胞或靶分子。 （3）竞争性抑制作用/拮抗作用(Competitive inhibition) 与体内产生或体外进入的物质结合，阻止其 与靶分子作用产生毒性损害。 （4）抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（Ab dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）及补体依赖性细胞溶解作用（ Complementarity dependent cytolysis, CDC） 。 （5）通过内影像作用模拟抗原，使疫苗更具安全 性及广泛性。 2. 抗体的治疗应用(Cure application of Ab) 随着抗体制备技术的进步，治疗性抗体已逐渐 从实验室走向临床，并在多种疾病的治疗方面展示 了光辉的前景。 （1）抗肿瘤作用(Anti-tumor) 由于多克隆抗体本身的局限性，所以直到单克 隆抗体出现，抗体用于抗肿瘤治疗才真正得以实现 ，自从1978年成功制备第一株抗黑色素瘤单抗以来 （Steplewski 1979），出现了抗胃肠癌、肺癌、乳 腺癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、神经胶质瘤等的 单克隆抗体，并于1980年首次在美国开展了单克隆 抗体肿瘤治疗的临床试验。 1983年Miller等报道了一例经单克隆抗体 治疗的淋巴瘤患者，在放疗、化疗及干扰素治 疗后，使用单克隆抗体治疗存活超过了4年。 单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的机制可能是： 抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（ADCC） 及补体依赖性细胞溶解作用（CDC）。 单克隆抗体与药物、毒素或放射性物质偶联， 成为一种全新的“生物导弹”，可用于导向治疗 。 单抗给予T细胞所必需的重要表面信号分子交联 的刺激信号和生长信号，体外诱导肿瘤特异性细 胞毒T淋巴细胞（tumor specific cytolytic T lymphocytes ，TS-CTLs）可用于特异性、被动性 的免疫治疗。 （2）抗感染作用(Anti-infection) 应用疫苗、免疫球蛋白，预防和治疗感 染性疾病。（对不能获得相应疫苗的病毒 感染，AIDS及一些危重情况，如内毒素休 克等则无效） 被动抗体疗法主要机制是中和病毒，并已 证明抗体在体外及体内中和病毒的效应不 依赖于Fc介导的功能和双价的存在，但可 能受抗体亲和力影响。 （3）抗器官移植排斥反应(Anti-repelling of organ transplant) 抗体主要通过阻断异体抗原的识别及排斥途 径和分子机制中的某一环节，产生免疫抑制效 应，预防排斥反应发生。 Tc共有的分化抗原CD3（Cluster of differentiation ）分子及IL-2R 对T细胞的 活化、增殖起重要作用，因此抗CD3及抗IL-2R 工程抗体的研究较为多见。 （4）抗血栓形成(Anti-formation of thrombus ) 封闭血小板糖蛋白b/a 整合素受体，是血 栓性疾病治疗上的突破（Tubeliverst 1999）。 近年来许多关于抗GPb/a单抗C7E3的研究表 明，C7E3能对90%以上的受体产生阻断效应，减少 了35%高危的经皮腔冠脉介入治疗（PTCA）后缺血 性并发症及27% 6个月内的临床再狭窄的发生，并 证明C7E3能预防动脉但不能预防静脉的血栓再形 成。 （5）解毒(Detoxicating) 对药物或动物毒素中毒患者，免疫治疗是应用 抗该药物或毒素特异性抗体或其片段。抗体与 毒素形成复合物，改变了毒素的药物动力学， 使毒素与受体解离，从其结合部位呈梯度流出 ，进入血循环中。 这种方法对强心苷中毒有明确疗效。基因工程 抗体对百草枯及蛇毒中毒也有一定作用。 （6）构建抗独特型抗体疫苗(Constuction of anti-idiotype vaccine) 抗独特型抗体在结构和功能上均能模拟 抗原（内影像作用）而发挥效应。据此构 建的独特型疫苗模拟肿瘤相关蛋白抗原， 能诱导抗肿瘤免疫反应。 （7）在自身免疫性疾病及变态反应性疾病 中的应用（apply to immunity disease and abnormality reaction） 自身免疫病多与单或寡克隆抗体的异常增多有关 。 利用基因工程技术制备针对这些异常抗体独特型 的抗抗体或与自身抗体结合并抑制其作用；或制 备能模拟抗原的内影像抗体用于中和体内的自身 抗体。针对不同发病机制，治疗方法趋于多样化 。 n 许多变态反应与IgE有关。Fc片 段可与变应原特异性IgE竞争结合嗜 碱性粒细胞，封闭变应原介导的组 胺释放。还可生产出与患者IgE竞争 结合变应原的Fab样分子。 第二节 抗体的分类、结构、功能特 点 （Class、structure and function of Ab ） 一、抗体的分类（Class） 抗体分为单克隆抗体、多克隆抗体 及基因工程抗体三类。 （二）单克隆抗体（Monoclone Ab） 识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性 抗体，称之为单克隆抗体（第二代抗体）。 p其特异性高、亲和力强、效价高、血清交叉反应 少等优点，已经在基础研究、临床诊断及治疗、 免疫预防等领域发挥了重要作用。近年来用单抗 与核素、各种毒素或药物偶联或基因重组制备成 导向药物，用于肿瘤的治疗成为研究的重点。 p单抗可以分两种形式 1、全抗 2、酶解片段 由于治疗用的单抗均非人源的，所以 去除Fc段的酶解片段可以降低抗原性，减 少人抗鼠反应，主要用于导向治疗。 1.木瓜蛋白酶的水解片段 （1）裂解部位：IgG铰链区H链链间二硫 键近N端侧切断。 （2）裂解片段： 两个Fab段（抗原结合段） 一个Fc段（可结晶段） 2.胃蛋白酶的水解片段 （1）裂解部位：铰链区H链链间二硫键近C端切。 （2）裂解片段： F(ab)2包括一对完整的L链和由链间二硫键相 连一对略大于Fab中Fd的H链，称为Fd含235个 氨基酸残基；F(ab)2具有双价抗体活性。 Fc可继续被胃蛋白酶消化成更小的片段，失 去其生物学活性。（pc ） 抗体的制备图 应用单克隆抗体全抗或酶解片段在动物试验 及临床试验中已经取得了较为良好的结果，一 些实验结果报告如下： p 131I-CMU72在人胃癌细胞系MGC80-3裸鼠移植模型的导向治 疗中显示有明显的抑制作用，且清除率低，显像时间长，提 示在胃癌临床导向研究上将有光辉的应用前景。 p131I标记抗人扁豆凝聚素结合型甲胎蛋白异质性抗体（AFP-R -LCA-McAb）后，在裸鼠实验性肝癌模型中获得良好的治疗效 果，85%的肿瘤生长明显抑制，表明AFP-R-LCA-McAb对人肝癌 细胞有较高的特异性和亲和力，有希望成为肝癌放免治疗的 理想载体。 抗淋巴细胞单克隆抗体（SALM）治疗恶性淋 巴瘤临床试验显示对非何杰金氏淋巴瘤疗效 显著，可能与抗体依赖的细胞介导的细胞毒 作用有关，另外可能由于SALM对此类淋巴瘤 有特异性疗效。 抗绿脓杆菌单抗进行保护小鼠抗绿脓杆菌 感染实验中作外敷治疗，证明可显著增强人 体中性粒细胞对绿脓杆菌的吞噬，应用于烧 伤创面抗绿脓杆菌感染获得满意效果，且未 见过敏反应。 抗人脑胶质瘤单抗S2-39与阿霉素结 合、胃癌单抗3H11与丝裂霉素交联及 抗人胰腺癌YPC3单抗介导的LAK细胞 体外、体内的试验也均显示较好的结 果。单克隆抗体具有许多优点，但其 本身也存在一些问题。 （1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性 由于人/人杂交瘤技术还存在很难 克服的障碍，目前绝大多数单克隆抗体 为鼠源性，因此对人体仍有较强的免疫 原性，使用后可产生人抗鼠抗体，从而 干扰了单克隆抗体在体内的合理分布， 重复使用会降低抗体疗效或发生超敏反 应。 （2）半衰期短 杂交瘤制备的单克隆抗体半衰期一般较短，不 利于其发挥生物学效应。 （3）靶吸收差 单克隆为完整的抗体分子，相对分子质量很大 ，很难通过血管进入细胞间隙，因此在靶部位（特别 是肿瘤），单克隆抗体的摄取量非常低，大大降低了 治疗效果。酶解片段较全抗在这方面有所改善。 （4）生产复杂，价格昂贵 （三）基因工程抗体（Gene Engineering Ab） 目前绝大多数单克隆抗体是鼠源的，临床重复给药 时体内产生抗鼠抗体，使临床疗效减弱或消失。 因此，临床应用理想的单克隆抗体应是人源的，但 人人杂交瘤技术目前未突破，即使研制成功，也还 存在人人杂交瘤体外传代不稳定，抗体亲和力低及 产量不高等问题。较好的解决办法是研制基因工程抗 体，以代替鼠源单克隆抗体。 基因工程抗体兴起于20世纪80年代早期。这一 技术是将对抗体基因结构与功能的了解与DNA 重组技术相结合，根据研究者的意图在基因水 平对抗体分子进行切割、拼接或修饰，甚至人 工全合成后导入受体细胞表达，产生新型抗体 ，也称第三代抗体。 本章将分四个部分：鼠单克隆抗体的人源化、 小分子抗体、特殊类型的基因工程抗体、人源 性抗体，对基因工作抗体的原理、制备及近年 的进展加以详细介绍。 1.鼠单克隆抗体的人源化(Humanization of Mouse McAb) 鼠单克隆抗体的人源化，就是为克服鼠源McAb 的免疫原性而将其进行改造，使之和人体内的抗 体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系 统的识别，避免诱导人抗鼠免疫反应。 因而抗体的人源化有两个基本的原则：保持或 提高抗体的亲和力和特异性；大大降低或消除抗 体的免疫原性。 第一代人源化抗体是将鼠McAb的可变区和 人抗体的恒定区组成嵌合抗体（Billeta 1993）。其独特的抗原亲和力保持得很好， 但因为有鼠单抗可变区的存在，仍有强烈的 HAMA反应。（人抗鼠抗体反应） 进一步将鼠McAb可变区中相对保守的 FR按成人的FR框架区（frame-work region），仅仅保留抗原结合部位CDR（ 即CDR移植互补决定区），这才是真正意 义上的抗体人源化，该种抗体又称为CDR 移植抗体或改型抗体。 （1）人-鼠嵌合抗体（Human-mouse Chimeric Ab） 由于人抗鼠免疫反应（HAMA）90%是针对C区的， 因此设计用人C区替代鼠C（constant）区，则可 能使鼠源性单克隆抗体的免疫原性明显减弱，嵌 合抗体的基本原理就是从分泌某种鼠单克隆抗体 的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能 性鼠IgV区基因，经基因重组与人IgC 区基因按一 定方式相拼接，克隆到表达载体中构建鼠/人嵌合 的轻重链基因表达载体，并转入适当的宿主细胞 表达来制备特异性嵌合抗体。 通过构建嵌合抗体，用人C区取代鼠C区，可 以较好解决鼠源性单克隆抗体诱发HAMA等不良 反应，延长单克隆抗体的半衰期，改善单克隆 抗体的药物动力学。嵌合抗体已经用于抗肿瘤 、抗感染、抗自身免疫等疾病的治疗，并已显 示出良好的治疗效果。嵌合抗体诱发HAMA率仍 较高，在导向诊断、导向治疗等方面的应用将 会受到限制。 u嵌合抗体已经用于治疗黑色素转移瘤，该抗 体含有人IgG1链C区与鼠V区14.18，可特异识 别神经母细胞瘤及黑色素瘤表面的GD2糖脂。大 部分患者症状得到完全或部分缓解，也出现了 一些副作用，如关节痛、瘙痒、短时瞳孔反应 消失等（Saleh 1992）。一些嵌合抗体分别用 于胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、骨髓瘤 、急性白血病等的治疗，证明嵌合抗体有较好 的抗肿瘤活性。 （2）改型抗体（Human ization Antibody人源化Ab） 又称人源化抗体，尽管绝大多数HAMA反应是 针对C区的，但有些单克隆抗体如OKT3用于人 体时，其HAMA反应则主要是针对V区的，如果 再把嵌合抗体的鼠FR区替换成人FR区，则可能 减少单克隆抗体的免疫原性。研究指出，抗体 与抗原结合的特异性和亲和力主要取决于其V 区的6个互补CDR区(互补Ag决定区)。 n 如果把人单克隆抗体的CDR区置换成鼠单克 隆抗体CDR区，这样的重组抗体的人源化可达 97%，在保留鼠源单克隆抗体特异性与亲和力 的同时，又可大大降低单克隆抗体的免疫原 性，发挥更佳疗效。 n但是，由于人源化抗体的构建需要替换CDR 区，而且还得预先得到抗体基因序列，技术 相当复杂. 抗肿瘤治疗: 人源化抗CDw52抗体用于治疗两例非何杰 金氏淋巴瘤，43天后仍未发生HAHA反应，血 液及骨髓中的淋巴瘤细胞全部消失，脾肿大 消退，且不抑制骨髓的正常增殖，在治疗白 血病的临床试验中表明，抗体无明显的毒性 及抗原性。 抗类风湿性关节炎: 人源化抗体可用于RA的临床治疗， 但具有轻度到中度的毒性，且只能短 暂改善RA症状，说明尚需进一步的改 进。 抗移植反应: 人源化抗体，包括IL2T，抗CD3等抗 体已经用于抗移植反应这方面的治疗。 抗IL2R人源化抗体抗-Tac-H 用于食蟹 猴异体心脏移植，表明抗-Tac -H是一种 较理想的抗排斥反应物，CD3抗体也同样 具有抗移植反应的作用。 抗病毒: 人源化抗HSV gB及gD糖蛋白抗体的亲 和力，中和HSV以及细胞保护力等明显高 于其亲本单克隆抗体，如人源化的抗RSV 抗体RSHZ19。保护性明显优于人免疫血 清球蛋白。 抗TNF: 人源化抗TNF-抗体Mab780具有部分中 和TNF-能力，并能竞争性拮抗其亲本单 克隆抗体或嵌合抗体对TNF-的结合。 抗过敏反应: 人源化抗IgE MaE11抗体已经显示了这方 面的能力。 2.小分子抗体（Small Molecular Ab） 完整的抗体分子，相对分子质量较大，难以 穿过血管壁，影响了靶部位对其的摄取。特别 是肿瘤细胞，血供本来就不丰富，对抗体的摄 取量就更少了。 因此对抗体分子进行改造，使之成为小分子 抗体。 小分子抗体可分为Fab抗体、单链抗体、单域 抗体、超变区多肽等四种。 （1）Fab抗体 l 抗体的Fab段由重链V区（VH）及CH1功能区 与轻链间以二硫键形式连接而成，主要发挥 抗体的抗原结合功能。 lFab抗体是对Fab段进行改造而获得的基因工 程抗体。即将抗体分子的重链VH区和CH1功能 区的cDNA与轻链完整的cDNA连接在一起，克 隆到适当的表达载体后，在大肠杆菌等宿主 中表达出有特异性抗原结合能力的Fab抗体。 Fab抗体大小只有完整IgG的1/3。下面介绍几 个已应用于临床试验的治疗性Fab抗体。 抗地高辛Fab抗体 : 具有明显的抗地高辛中毒作用，可用于洋 地黄中毒患者，可恢复房室传导阻滞。 抗去郁敏Fab抗体: 在去郁敏（desipramine,DMI）心肌中毒 的小鼠模型中应用羊抗去郁敏Fab后，可明显 改善QRS间隙时间及心率，而且大剂量的效果 更佳。 抗血小板GPIIbII/IIIa受体Fab抗体： 用不同剂量的抗血小板GPIIbIIIa受体Fab m7E3抗体治疗稳定型心绞痛患者，发现Fab抗体 以依赖性方式抑制血小板凝聚。 抗HSV Fab抗体： 抗HSV Fab19可特异识别多株不同的HSV-1 及HSV-2.有100%的中和作用。 （2）单链抗体(Single chain Ab) 在重链V区cDNA3端（VH端）与轻链V区 cDNA5端（VL端）之间，用一寡聚核苷酸接头（ linker，14-25个aa为宜）连接成单链可变区基 因片段，再与相应的载体体外重组，转化至受 体细胞，表达出一具有抗原结合能力的单链抗 体多肽，其大小只为完整抗体的1/6。应用现状 简介如下： 放射免疫疗法 放射性免疫疗法的原理与体内成像相似 ，必须有足够量的放射性标ScFv（单链可变 区片段）定位于靶部位，达到发挥放射性治 疗的水平。ScFv的快速清除使非结合的放射 性标记ScFv迅速排出，这也是ScFv有别与Fab 片段的重要优点之一。 免疫毒素治疗 ScFv免疫毒素的细胞毒作用有时比化 学合成的免疫毒素高15100倍以上，其他 效应功能区可与ScFv-毒素融合，加强靶细 胞的杀伤作用。 体内药物解毒作用 由于ScFv的清除率比Fab快，因此ScFv可能 具有更强的解毒作用，如26-10ScFv可用于治 疗地高辛中毒。 ScFv作为小分子抗体，保留了亲本单克隆 抗体结合抗原的特异性，又使其抗原性大大降 低，其药物动力学优于Fab抗体或IgG等完整抗 体。ScFv相对分子质量很小，能有效进入完整 抗体无法到达的靶部位，如病毒的“峡谷”部 位及肿瘤内部ScFv。 VHcDNA3端 VLcDNA5端 +寡核苷酸 linker 重组DNA + 分子载体（vector） 限制酶 连接酶 体外重组DNA分子 转化 E.coli表达ScAb 单链抗体的制备流程图 （3）单域抗体（Single domain Ab） 抗体结合抗原主要由V区决定，只含有V区 基因片段表达的小分子抗体，即只有VH 或VL 一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的 特异性。这种小分子就称为单域抗体（ single domain antibody），其相对分子质 量仅为完整抗体分子的1/12，故也称之为小 抗体。 单域抗体仅有一个结构域，制 备相当简单，表达出有活性的抗 体片段，因此也不失为一种有良 好应用前景的基因工程抗体。 与Fab、ScFv相比，单域抗体的相对分子 质量更小，更容易穿过靶组织，可以阻断 病毒表面的“峡谷”部位，加强对实体瘤 的渗透，得到分辨率更高的成像图谱。但 由于VH单域抗体不含有VL片段，VH的疏水 面暴露较大面积，致使其抗原亲和力大幅 度下降，非特异性吸附有所增加，因此将 单域抗体作为一种治疗性抗体应用还有许 多问题要解决。 （4）超变区多肽（hypervariable region polypeptide） 抗体结合抗原都要通过CDR来实现，因此CDR是抗 体结合抗原的最小结构单位。 经晶体结构等分析，发现抗体分子中6个CDR所起 的作用是不同的。可以设计出那些在抗原识别及 亲和力方面有重要意义的CDR多肽，直接用于诊断 或治疗，可望获得理想的结果。 这种只含有一个CDR多肽的抗体，就称之为超变 区多肽（hypervariable region peptide）。 超变区多肽的氨基酸序列与CDR区完全一致， 大小只有16-30个氨基酸，相对分子质量很小 ，对组织细胞具有极强的穿透性，能达到其他 抗体不能到达的部位。所制备的87、92、 6McAb VH功能区的CDR2多肽，其特异性与亲代 抗体相似，能与某些细胞表面的呼肠孤病毒 III型受体有效结合，使该受体表达下降，并 抑制细胞内DNA的合成。 超变区多肽可用同位素、荧光素标记或与 毒素、药物等结合，用于疾病的诊断及治疗， 已经用于临床检测肿瘤。 应该看到，由于只含有一个CDR区，它的 结合抗原能力是不完全及不稳定的，其亲和力 及非特异性吸附都可能明显增加，相对分子质 量极小，在体内相当不稳定，可能还没有完全 发挥其生物学效应时已被清除。 3. 特殊类型的基因工程抗体（special type ofgene engineering Ab） 根据构建方式的不同主要分为三种： 双特异性抗体； 免疫黏连素； 催化抗体。 （1）双特异性抗体（Bispecific Ab，BsAb） 天然的抗体分子为双价单特异性，如果对天然的抗 体分子进行改造，把其他的效应物质如毒素、酶、 细胞因子、受体分子通过一定方法与两种杂交抗体 Fab片段或V区（VH与VL）连接起来，使之即可与靶 细胞结合，又可介导其他一些效应功能，从而最大 限度地杀伤靶细胞。这种具有双特异性的抗体分子 就称为双特异性抗体或双功能抗体。 BsAb（双特异性抗体）是基因工 程抗体研究的重点，已经构建了 大量的BsAb，在基础研究、临床 诊断、治疗等方面发挥了重要的 作用。 抗肿瘤 介导活化的T淋巴细胞。 介导巨噬细胞的肿瘤免疫疗法。 除了介导肿瘤细胞与效应细胞的结 合外，BsAb还可用于向肿瘤细胞输送 免疫毒素。 BsAb还用于介导其他药物的肿瘤杀 伤作用。 抗血栓形成 通过化学交联物制备完整抗纤维蛋白单克隆抗 体与抗组织纤维蛋白酶原激活物抗体（抗tPA） BsAb。在体内、外均能有效地介导纤维蛋白酶原激 活物与纤维血栓的结合，通过特异聚集tPA于血凝 块处，在明显减少tPA量的情况下诱发了其强有力 的治疗效应，可以对抗血栓形成，同时也避免纤维 蛋白原的溶解及出血的副作用。 抗感染作用 BsAb一样适用于介导病原体的代谢。 BsAb构建法： 化学交联法：SPDP（琥珀酰胺吡啶二硫酚丙 酸）随机交联2个Ig分子表面上的巯基构建出 双功能Ab。 生物学法（杂种杂交瘤法）： 分泌McAb的杂交瘤C 分泌另一种Ab的脾C 融合 杂种-杂交瘤C 分泌 杂种Ab 2种亲代Ab gene工程法：构建出的小分子双特 异性Ab（SCFV）2（双功能Ab）将不同 Ab的VH和VL区的gene用接头（Linker ）连接，生成原Ab的分子内配对（不 能形成链内的分子配对）Bs Ab （SCFV）2。 （2）免疫黏连素（Immunoadhesin） 人细胞受体或黏附分子等基因通过一定的方 式与抗体的恒定区gene（主要是Fc段）的N端连接 起来，在真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体 样蛋白质分子，这种分子可同时发挥抗体的效应 功能及其他效应功能。与双特异性抗体不同的是 ，免疫黏连素由于不含有抗体的Fab段，但可发挥 抗体的特异性效应功能，还含有细胞受体的结合 位点，可特异性与受体阳性细胞高亲和结合，发 挥新的效应功能。 优点： 亲和力强； 半衰期长； 大大隆低了其工作浓度； 减少非特异副作用及HAMA发 生率，应用上比亲本单克隆抗 体更为安全可靠。 （3）催化抗体（Catalytic Ab or Ab Enzyme） 抗体能与抗原特异结合，酶也能与其底物特异 结合，但这两种结合过程本质不同。天然的抗体 不具有酶结合活性，而酶则无抗原结合能力。如 果能人工设计一类新型蛋白质，使之同时具有抗 原结合的专一性及催化底物的特异性，这种高效 的抗体催化剂将可能应用于化学、生物学、临床 医学等领域，为生物催化提供新的理论基础. 根据免疫学及生物化学的基本原理，利用 基因工程技术，目前已经成功制备了这类 催化抗体或抗体酶。抗体酶的高效催化特 性及位点特异性蛋白裂解酶活性为临床疾 病治疗提供了新的途径，并非常有可能成 为肿瘤导向治疗的新方法。 基因工程催化抗体的构建是通过在轻链 V区中插入能与金属离子结合的氨基酸序 列，再与重链V区重组，这种重组抗体的 重链V区可识别抗原并选择性结合底物， 轻链则可通过促进底物反应过渡态的形 成而发挥催化作用。 4.人源性抗体（Human Ab） 由于鼠源性抗体治疗应用中存在着程度不 一的人抗鼠的Ab的HAMA反应，由于人-人杂 交瘤的不稳定等缺点使得通过传统杂交瘤技 术分离高亲和力的稳定人抗体克隆变得十分 困难。 近年来，创建了噬菌体抗体库技术和基因 敲除、置换技术，并利用这两种技术成功地 制备了完全人源化的抗体片段及全抗。 （1）噬菌体抗体库（phage Ab Library） 利用基因工程的方法可将全套人抗体重链和 轻链V区基因克隆出来，并在噬菌体表面表达、 分泌，经筛选后获得特异性抗体，这种技术称为 噬菌体抗体库(phage antibody library)，所构 建的抗体库称为全套抗体库（repertoire antibody）或组合抗体库（combinatorial antibody library）。 基本原理 该技术以噬菌体为载体，将抗体基因（Fab 或ScFv基因等）与噬菌体编码的外壳蛋白（ CP）或（CP）相连，在噬菌体表面以抗体 -外壳蛋白融合蛋白的形式表达。经辅助病毒感 染后，借助CP的信号肽穿膜作用，进入宿主细 胞的外周基质，在正确折叠后被包装于噬菌体尾 部，随后携带有表达载体的宿主菌就会释放出带 有抗体片段噬菌体颗粒。可以特异识别抗原，又 能感染宿主进行再扩增，因此可以采用类似于亲 和层折原理从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体 。 1990年Mullinax等首次从受破伤风毒素免疫 的供者外周血B细胞中组建了人抗体库，容量达 107，筛选出10株抗TT单抗。这是首例用抗体库 技术获得的全人源化抗体，开创了单抗制备的 新纪元。 噬菌体抗体库技术与传统的杂交瘤技术相比具有 明显的优越性： 简便易行，节省时间； 筛选的容量大，用杂交瘤技术只能在数月内筛选 数千个克隆，而噬菌体抗体库技术则可以数周内筛 选出106-108个克隆； 抗体库技术直接得到抗体基因，避免了杂交瘤细 胞克隆不稳定的缺点； 抗体库抗体可用原核细胞表达，无需组织培养， 可大大降低单克隆抗体生产的成本。噬菌体抗体库 技术在不久在将来将有可能取代杂交瘤技术。 （2）Xenomouse（异源性或异基因鼠） 产生的人源性抗体 噬菌体抗体库制备的抗体通常为Fab片段 或ScFv抗体，由于没有Fc段，亲和力受到极大 影响，人们试图通过基因工程的手段来制备人 源性抗体全抗。 1997年Abgenix公司在这方面取得了重大 突破，研制成功了Xenomouse，利用这种小鼠 可制备高亲和力的人源性抗体全抗。原理就是 ：将小鼠的全套抗体基因去除，同时将人的大 部分轻链、重链基因插入到小鼠的染色体当中 ，这样用抗原刺激小鼠时就可以发生人抗体基 因的重排，从而产生人源性抗体（Mendez1997 ）。 第三节 单克隆抗体（McAb） 1986年许多研究人员和公司花费了巨大的人 力、物力和财力进行了治疗性抗体的研制和 开发，使治疗性抗体的发展达到高潮。 如今单克隆抗体再次成为生物技术研发的热 点课题。记录在案的Mabs（双特异鼠Ab）至 少有69种。 大部分的Mabs是为治疗癌症而设计的， 这些精心研制的抗体可识别出癌症细胞 所显示的抗原； 另一部分的Mabs是为了治疗多发性硬化 、类风湿性关节炎和其他一些疾病而设 计的。 另外，甚至完全人源化的Mabs也正在开 发之中。 称为17-1A的Mab已在德国获准上市， 这是第一种用以治疗癌症的Mab。最早 获得美国FDA批准上市的治疗性单抗是 抗CD3单抗和Cpb/a单抗。 我国自20世纪80年代开始进行治疗性抗体的研究 和开发，经过10多年的努力，特别是近5年来，治 疗性抗体有了重大的进展，到目前为止已有几种 治疗性单抗获得国家批准进入临床试验。 马文煜教授及其课题组经过9年艰辛探索，在国 内外首次将流行性乙型脑炎单克隆抗体用于临床 治疗，并成功地建立了猴体乙脑模型及治疗实验 ，作为国家I类新药已通过国家卫生部新药审评， 进入了期临床试验。 p细胞工程中心陈志南主任开发的肝癌单 克隆抗体导向治疗剂131I标记的Hab18及 131I标记的酶解片段F（ab）2作为国家I类 新药均获得国家批准，进入了期临床试 验。 现将美国正在开发的治疗性抗体列表如下： 名称 属性 研制单位 用途开发现状 2B1 双特异鼠MabNational Cancer Institute 乳腺癌/期 4197X-RA免疫毒素Houston Biotech 预防继发 性白内障 期 AD-439MAb中和抗体抗 HIV-gp130蛋 白的V3环 Tanox Biosystem s HIV感染， 爱滋病 期 AD-439和AD -519组合 全抗 Tanox Biosystem s HIV感染， 爱滋病 期 AD-519Mab中和抗体抗 HIV-gp210蛋 白的C4区 Tanox Biosystem s HIV感染， 爱滋病 期 AL-901抗人IgETanox Biosystem s 过敏性疾病， 包括对过敏性 鼻炎和哮喘 期 ALG-991嵌合MabAllergene 有毒常春藤临床 试验 Herceptin抗-HER-2人 源化Mab Genetech乳腺癌上市 抗IgE人源化MabGenetech哮喘期 Avicidin Mab结合物NeoRx各种实体瘤期 Biostent NeoRx 消除血管成 形术后血管 痉挛 期 RB96阿霉素结合 物 Bristol- Myers Squibb 癌症期 BTI-322MabMedImmune ， BioTranspl ant 急性肾排斥 ，移植物抗 宿主病 /期 C225抗EGFR嵌 合Mab ImClone System 表皮生长因子 受体阳性癌症 期 Centara嵌合抗CD4 抗体 Centocor 风湿性关节炎 ，T细胞淋巴 瘤 期 Cen TNF 嵌合抗CD4 抗体 Centocor风湿性关节炎 ，炎性肠道疾 病 期 CMA-676Wyeth- Ayerst Lab 复发的急性髓 性白血病 期 CMB-401Wyeth- Ayerst Lab 卵巢癌期 Corsevin M 12D10- Fab Fab抗体Centocor， Corvas PTCA的溶血栓 并发症，分散 血管内凝血 期 E5MabPizer， XOMA 革兰氏阴性脓 毒症 期 Enlimomab抗ICAM-1 Mab Bochringer Ingelhein 中风 热损伤 /期 期 Hu23F2G 重组人源化 单抗 ICOS 出血性休克 多发性硬化 期 期 人抗乙肝抗体工程的全-B抗体 Protein Design Labs 因慢性乙肝炎 感染引起的晚 期肾病的肝移 植患者和慢性 活动期乙型肝 炎患者 /期 IDEC-Y2B8IDEC制药公 司 非何杰金氏B- 细胞淋巴瘤 期 IDEC-InB8IDEC制药公司非何杰金氏B- 细胞淋巴瘤 期 IDEC-Y2B8IDEC制药公司非何杰金氏B- 细胞淋巴瘤 期 Immu RAIT- CEAI I131-完整的 IgG Immunomedics结直肠癌期 Immu RAIT-LL2I131-完整的 IgG Immunomedics非何杰金氏B- 细胞淋巴瘤 期 L54565Pharmacia and Upjohn