端粒与端粒酶_1课件

端粒和端粒酶那些事儿 生物技术（动物）二班 赵凯 81080303 先铺垫一下 DNA链 主鏈上的醣類 主链上的糖类 DNA的主鏈是由醣類和磷酸根的模型重複堆疊而成。 DNA的主链是由糖 类和磷酸根的模型重复堆叠而成。 由DNA的全名去氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid）可得知DNA中的醣類是去氧核糖。由DNA的全名 去氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）可得知DNA中的糖类是去氧核糖 。 去氧核糖是由核糖脫去一個氧原子後所得到的醣類，而核糖則是構成 RNA（ribonucleic acid，核醣核酸）主鏈的醣類。去氧核糖是由核糖脱去 一个氧原子后所得到的糖类，而核糖则是构成RNA（ribonucleic acid，核 糖核酸）主链的糖类。 下圖分別是去氧核糖和核糖的結構式。下图分别 是去氧核糖和核糖的结构式。 脱氧（核糖）核苷酸（deoxyribonucleotide）： 3，5一脱氧核糖核苷酸 Deoxyadenosine 3- monphosphate (3- dAMP) Deoxyadenosine 5- monphosphate (5- dAMP) 消失的DNA DNA 复制为半不连续复制( Semi-discontinuous replication) 是生物界最基本和普遍的DNA 复制方 式,然而,这种方式在环状DNA 的复制中表现的似 乎完美,但在染色体线形DNA 的复制中却存在着一 些问题. 在滞后链末端的一段DNA 序列最终未被复 制,或换句话说每次所复制的子代DNA 都将较其亲 本DNA 丢失一段DNA 序列,这也就是所谓的 末端 复制问题(End replication problem) . 所丢失 的DNA 序列长约50 - 100 bp. 但问题尚未到此为止, 这种“不精确”的DNA 复制的动因和意义是什么,其在 生物体中的作用和机制是什么? DNA聚合酶 I 催化合成DNA时，需 要自由3OH作为引物，最后余下 子链的5无法填补，于是染色体就 短了一点。 科学家们开始试着寻找答案 (1) 早在20 世纪30 年代,Muller 和Mc Clintack 分别发现了染色体末端的一种特殊序列,诺贝尔奖 金获得者Muller 首先发现被X射线打断的果蝇染色 体末端极不稳定,并根据希腊文组词将其命名为端 粒(Telomere) . (2) 20 世纪70 年代Olovnikov 提出染色体末端 的丢失可能会导致细胞退出增殖假设,但未能提供 较为直接的证据. (3) 1978 年,Blackbum 和Greider 等人克隆了四 膜虫的端粒结构3 ,一种串联的线性核酸重复序列; 5GGGGGTT3DNA 简单序列. 后来证明人和 脊椎动物的端粒均为含有丰富的鸟嘌呤( G) 的重复 DNA 序列,人类端粒与5TTAGGG3的重复单位构 成,长度在5 - 15 Kb 范围. (4) 1985 年,Gueider 等发现一种酶,即端粒酶, 可用这种简单序列给端粒DNA“加尾”. 哇！大师们 端粒假说 1、端粒随细胞分裂次数的增加 而缩短,达到一定程度后启动某 些信号,细胞开始衰老死亡期 (M1) 期 2、此时若一些癌基因、抑癌基 因突变,则有可能使细胞越过M1 期继续分裂,端粒继续缩短,并最 终还可出现(M2 期) . 3、如此时端粒酶激活,则又可 使细胞越过M2 期,并由于端粒 功能的恢复而永生化. 补充 (1) 端粒即染色体线状DNA 末端与一些端粒 DNA 结合蛋白构成的结构; (2) 末端复制问题是调控生物寿命的正常机 制,端粒DNA 的长度是细胞寿命的“计数器”; (3) 端粒酶可通过“加尾”的方式补充复制时 丢失的端粒DNA ,延长细胞的寿命; (4) 一些端粒相关蛋白参与端粒酶或端粒的 调控; (5) 肿瘤细胞很可能成功地利用了端粒酶或 其调控机制而获得永生. 不能忽略的功臣四膜虫 说个小插曲。端粒的发现和重要功能揭示，离不开 一种独特的真核生物生物四膜虫。它外观呈椭 圆长梨状，体长约50微米，与头发丝粗细相当。它 的特殊在于，大细胞核里的染色体能大珠小珠落玉 盘断裂成上百个小染色体。复制过后，则变成 上万个。由于每个染色体末端都有端粒，四膜虫无 疑是端粒的富矿。布莱克本的系列研究，正是基于 它而揭示端粒及端粒酶的作用的。 端粒( Telomere)篇 综述：端粒是保护真核细胞染色体末端并 维持其完整的特殊的DNA/蛋白质 复合结构，它像“帽子”一样扣 在染色体两端，从而维护染色体 的完整性和稳定性，防止染色体 被降解、融合和重组，以使分裂 后得到的子代细胞能准确获得完 整的遗传信息。 端粒的成分 端粒DNA 端粒结合蛋白 端粒结合蛋白 端粒结合蛋白（那些端粒结合或参与端粒调控的蛋白成分）包括两种： A、保卫蛋白复合体（Sheherin），由端粒重复序列结合因子（TERF1、TERF2), 端粒保卫蛋白1（POT1），TERF1相互作用 核蛋白（TIN2),TIN2相互作用蛋白1 （TINT1）及阻抑和活化蛋白1（Rap1）组成，各分布在染色体端粒上。 B、非保卫蛋白有DNA修复蛋白RADSO,NBSI,Ku86和DNAKsc等，各分布在不局 限的端粒上。 p TRF1 以同源二聚体的形式结合到端粒DNA 上,该蛋白通过抑制端粒酶结合端粒 末端而以负反馈的机制抑制端粒延长, 稳定端粒长度. TRF1 与tankyasel 、TIN2 和 PINX1(isoform 1 of Pin2-interacting protein X1 ,PINX1) 等因子相互作用即形成 shelterin 复合体. shelterin 复合体沿着端粒DNA 双链与其结合,端粒越长,结合的TRF1 复合体就越多, 负反馈的信号就越强. p Pot1 是TRF1 复合体控制端粒长度的最终传递体,其可能和TPP1 蛋白组成复合 体结合到单链DNA 末端,使端粒酶不能识别引物,从而不能启动端粒的延伸 . p TRF2 在染色质末端保护中的作用可能跟其与DNA损伤信号和修复因子之间的联 系相关,尤其是TRF2与Mrel1 复合体的组分相互作用,该复合体是非同源的末端融合 (nonhomologous end joining ,NHEJ ) 和同源重组机制的核心组分 . 而且,TRF2 也与 具有核苷酸切除修复作用的XPF2ERCC1 ( DNA repairprotein ,XPF ;X2ray repair cross complementing protein 1 , ERCC1. XPF2ERCC1 为包含这两种蛋白的复合体) 核酸酶、Apollo 核酸酶以及DNA 信号因子MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint 1 ,MDC1) 等密切相关15 ,16 . 进而TRF2 也 可结合ATM ( ataxia-telangiectasia mutated) 从而削弱由ATM 诱导的损伤应答. 这些 结果显示,TRF2 在防止端粒DNA 损伤应答过程中具有调节作用。 p TRF2 和Pot1 对端粒长度具有重要的调节作用,并可通过防止染色体末端融合而 保护染色体. 端粒DNA的结构 人们对端粒结构的认识是不断发展的。到目前为止，科学家们一共对其提示 出了两种解释：四联体结构和d-loop-t-loop假说 The classic view 端粒DNA有两条长短不同的DNA链组成。一条富含G，一条富含C。富含G的 那条链53指向染色体末端，此链比富含C的链在其3末端尾处可多出1216个核 苷酸长度，即3悬挂链（3overhang strand），一定条件下能形成一个大的具有规 律性很高的鸟嘌呤四联体结构，此结构是通过单链之间或单链内对应的残基之间形 成Hoogsteen碱基配对，从而使四段富含G的链旋聚段的四连体DNA。也有人认为 ，端粒G链序列可以形成稳定的发卡结构，它和四联体结构都被认为与DNA保护功 能有关。 不同物种端粒的重复序列和长度是不一样的，人类端粒DNA由5-TTAGGG-3 反复串联而成，不具有编码功能，进化高度保守，总长度约5-15kb，随着每次细胞 分裂的进行，染色体末端丢失50200bp。 The new view d-loop-t-loop假说 在Griffith等结合电镜观察提出端粒结构假说D-loop -T-loop。由于TRF2的存在，DNA双链形成“环状（T-loop ）”，而单链G尾的TTAAGGG在环的端口内侧与CCCTAA 碱基互补形成100-200碱基对D-loop，由此保护了DNA末端 不受损坏，而TRF2蛋白很可能结合于D-loop接口处参与了 T-loop-D-loop的形成与稳定。T不结构模式亦直接或间接地 参与染色体末端结构稳定性的维持。TRF2对端粒结构的稳 定可能提示了端粒酶的其他作用；随着DNA复制，端粒逐 渐缩短，TRF2结合位点逐渐减少至消失，端粒失去了 TRF2的保护作用。端粒酶通过在端粒末端合成TTAGGG重 复片段而提供TRF2结合位点，使TRF2蛋白结合于其上行 使防止染色体融合的功能。 端粒末端并非线性结构!而是富含个链 的3外部侵入端粒重复序列形成的环 状结构，称作T-环，并且在入侵处还 可形成D环。T-环和D环的基本作用 机制是提供端粒保护和复制端粒，而 端粒相关蛋白为T-环和D环的形成和 保护提供便利 端粒长度的作用模型 正常长度的端粒具有异染色质的特性,如亚端粒 DNA 的超甲基化、组蛋白H3 和H4 的超甲基化和超 乙酰基化、异染色质蛋白HP1 结合在端粒和亚端粒 区域,这些特征表明,端粒结构是压缩的致密结构,使端 粒酶无法接近同时抑制端粒重复之间的同源重组. 由 于端粒在细胞分裂过程中逐渐缩短,这些异染色质标 记在端粒和亚端粒区域将减少. 同时伴随组蛋白乙酰 化水平增加,这些修饰将导致染色质处于开放状态,从 而允许端粒延伸机制接近并延长端粒的长度. 一旦端 粒长度合适,细胞的检测机制将活化SUV239H 和 SUV220H甲基转移酶等一系列机制而重新聚集成为 异染色质. 细胞正是通过上述的循环机制而调节端粒 处于合适的长度,从而维持机体正常的发育过程. 引自高等教育出版社细胞生物学P463 端粒酶篇 综述：端粒酶( Telomerase)是一种由RNA 和蛋白质组成的特异核糖核酸蛋白复合体,具有逆 转录的酶活性, 能以自身的RNA 为模板5 - CUAACCCUAAC-3通过逆转录合成端粒重复序列 并连接到染色体末端以补偿细胞分裂时端粒的缩 短,使细胞获得无限增殖能力 端粒酶结构示意图 绿色蛋白质 浅褐色RNA 紫色DNA 端粒酶的组成（RNA+蛋白质 ） 端粒酶RNA hTR(human telomerase RNA) 又称hTERc (human telomerase RNA component) 端粒酶结合蛋白 hTEP1 ( telomeraseprotein 1) ,又称TLP 和 TP1 端粒酶活性催化亚单位 hTERT(human telomerase reverse transcriptase) 又称hTRT或hTEST2 或TP2. 影响因素端粒长度 端粒酶 端粒结合蛋白( TRF1、TRF2) 核糖基转移酶、核糖多聚酶 端粒酶的功能 修补端粒 修补染色体 去除错配碱基的纠错 作用，不仅可以除去 错配碱基，还可除去 延伸超过模板范围的 碱基 端粒酶之于永生及肿瘤 细胞衰老的化学机制 人们发现：肿瘤抑制蛋白p53和pRb失活会导致人成纤维细胞的永生化。pRb是 已知在细胞周期中发挥重要作用的调节因子。pRb能够与转录因子E2F家族成员 结合并抑制其转录活性，E2F负责转录G1/S期转换以及DNA合成过程中的若干 基因，当E2F活性被pRb封闭时，细胞将不进入S期而停在G1期。随着细胞周期 重要的调控因子cyclin依赖性的激酶（cyclin denpend kinase，CDK）的活 化，pRb被CDK磷酸化，磷酸化的pRb不能再与E2F结合，使得E2F被释放并活 化靶基因的转录，细胞就从G1期进入S期。如果CDK的正常活化被抑制，或者 Rb蛋白本身发生突变，导致pRb不能被磷酸化，就会使G1到S期的转换被停滞， 从而阻断细胞周期的正常运行，引发复制型的衰老。CDKs的活化受到细胞内多 种信号的调控，细胞内存在天然的CDK抑制因子（CDK ），p16和p21是其中 两个典型的抑制因子。P16抑制CDK4和CDK6的活性；p12抑制CDK2、CDK4和 CDK6的活性。现已证明二者均可引起细胞衰老。 -选自高等教育出版社细胞生物学P463 正常情况下：端粒酶的活性一般仅出现在胚胎细胞、肿瘤细胞和永生化细胞株 中 。（随着细胞有丝分裂的进行,端粒长度逐渐缩短,至一定长度则不能维持染色 体的稳定,而且在大多数正常体细胞中端粒酶不表达,细胞最终衰亡） 特殊情况下：肿瘤细胞（永生化细胞随着细胞分裂,其端粒长度稳定不变,或不 表现缩短与正常细胞相比,肿瘤细胞生长增殖更快,故其端粒更缩短,为维持染色体 末端的端粒稳定,此时会伴随端粒酶的激活. 端粒酶在恶性肿瘤中通过合成端粒 DNA ,阻止端粒丢失,是肿瘤细胞获得永生的必要条件）. 人类生殖细胞、造血干细胞含有较高的端粒酶活性，而普通体细胞中只表现极 低甚至无端粒酶活性，因此正常体细胞是不能无限增殖的。如果我们能通过像细胞 植入端粒酶而保持其端粒长度，染色体的稳定性便得以恢复，这样细胞的寿命就不 受分裂次数的限制而成为永生细胞。 激活端粒酶活性是有效的途径：Bodnar等使端粒酶活性本来为阴性的视网膜 色素上皮细胞和表皮成纤维细胞变成端粒酶活性为阳性后，发现有丝分裂次数增加 ，寿命得以延长至少20代。重建端粒酶活性后，在体外使经ptsA58H质粒转染的人 胚胎肌腱细胞寿命大大延长。Kyo等在端粒酶阴性的复制衰老前（presenescent） 细胞中异位表达hTERT会导致端粒酶活化，端粒延长，细胞绕过复制衰老而永生 。 此外，体外实验中，在多种端粒酶阴性的细胞中重建端粒酶活性，可以维持 端粒长度，增加细胞寿命，甚至使细胞永生化。但是否以上述方法使整个机体的细 胞得到“永生”后，就能使人类“青春永驻”甚至“返老还童”呢？人们正在探索之中， 敬请期待。 细胞永生的曙光 端粒磨损仅仅是细胞衰老原因之一， 细胞衰老也仅仅是个体衰老的 原因之一。总的来说，根据对端粒却缺陷老鼠的实验（鼠科衰老与人类 衰老有很多相似性）虽然端粒长度的缩短发生在许多人类衰老组织中， 端粒长度与年龄没有直接线性关系，因为端粒缩短最快是在青年时代。 然而，说端粒长度是个简陋的端粒结构指标是可能的，因为最短的端粒 似乎可以激发DNA损伤反映机制。 细胞衰老的分子机制 复制衰老（端粒）、 胁迫诱导早熟性衰老（不良环境及氧 化损伤） 个体衰老的原因：外界不良环境，遗传因子控制，干细胞衰 老等 Can we？ ？ 肿瘤的阴霾 北京医科大学的教授们用以下实验论证了端粒酶和肿瘤细胞的关系： 目的 探讨端粒酶基因表达与肿瘤恶性表型及其与端粒酶活性的关系;评价端粒 基因表达检测在肿瘤诊断中的价值 方法 用原位杂交的方法检测端粒酶基因hTR 和hTRT在78 例。人常见癌组织 ,20 例癌前病变,28 例良性病变中的表达及分布情况。 结果 78 例癌中hTR 阳性率为85 %(66/78) ,hTRT阳性率为82 %(64/78) ; 在癌 旁 组织中hTR、hTRT 的表达阳性率分别为3 %(2/78) 、5 %(4/78) ;20 例癌前 病变中hTR、hTRT阳性率分别为20 %(4/20) 、15 %(3/20) ; 28 例良性病变中 hTR、hTRT阳性率分别为0 %、4 %(1/28) 。癌组织中hTR 和hTRT 的表达与癌 旁、癌前病变、良性病变比较差异有显著性( P 10kb),随细胞有丝分裂,端粒缩短是个缓慢的过程, 这种情况下端粒酶抑制剂是否有效尚待进一步证实. 临床应用前景 肿瘤治疗方法 由于端粒在大多数肿瘤中表达,且在大部分正常体细胞中不表达, 因此,以端粒酶为肿瘤治疗新的靶点,正日益成为研究热点. 目前的研 究已经提出多种治疗的思路. 如直接抑制端粒酶活性,针对端粒酶成分 进行基因操作,诱导细胞分化等. 端粒酶活性的抑制成为当前肿瘤治疗研究的新热点. 抑制端粒酶 活性也许能成为治疗肿瘤的新方法. 它可能比化学疗法和基因疗法具 有更大的优势,端粒酶抑制剂具有较高的特异性和较少的副作用,并具 有广谱性. 传统疗法对早期肿瘤最有效,而端粒酶抑制剂可能对晚期和 扩散肿瘤也有效. 诊断与预后评估方面 端粒酶活性在良、恶性病变中的变异,以及它在某些肿瘤的早期 甚至癌前病变中出现,在分化低有转移倾向肿瘤更是高表达,使之在诊 断、鉴别诊断以及预后评估方面有一定的实用价值. 参考文献： 1.Telomeres Do D-LoopT-LoopCell, Vol. 97, 419422, May 14, 1999, Copyright 1999 by Cell Press 2.哺乳动物细胞衰老调节的新机制端粒的表观遗传修饰郭艳合, 张义 玲, 刘 立, 王毅刚, 钱 程，Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 3.端粒酶基因在人肿瘤组织中的表达，苑昕 张波 应建明 金燕燕 侯琳， 中华病理学杂志2000年2月第29卷第1期 Chin J Pathol , February 2000 , Vol 29 , No. 1 4。端粒、端粒酶的研究与人类肿瘤，刘 明，首都师范大学学报(自然科学版 ) Journal of Capital Normal University(Natural Science Edition)第23 卷 第1 期，2002 年3 月 5.人端粒酶RNA 基因与肿瘤的相关研究进展，李淑慧, 余忠华，中华肿瘤防 治杂志2009 年6 月第16 卷第12 期 CHIN J CANCER PREV TREAT ,J une 2009 ,Vol . 16 No. 12 6。 How stem cells age and whythis makes us grow old， Norman E. Sharpless* and Ronald A. DePinho， nat ure reviews molecular cell biology volume 8 sept ember 2007 7. The role of telomeres and telomerase in aging and cancer， Jerry W Shay， Cell Research (2006) 16:S54-S72 2006 IBCB, SIBS, CAS All rights reserved 1001-0602/06 8.Senescence Induced by Altered Telomere