谭蔚锋肝癌原发灶及胆管癌栓样本差异基因表达谱的分析课件

肝癌原发灶及胆管癌栓样本 差异基因表达谱的分析 东方肝胆外科医院胆道一科 谭蔚锋 罗祥基 姜小清 第六届中国肿瘤学术大会 现状 合并胆管癌栓（Bile duct tumor thrombi， BDT）的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)约占原发性肝癌病人总数的1.66% 4.9%。据此推算，我国每年合并胆管癌栓的肝细 胞癌（Hepatocellular carcinoma with bile duct tumor thrombi，HCCBDT）的新发病例约为 500015000人，因此，虽然HCCBDT发生率相对较 低，但是罹患者的绝对数量较大。 吸搴荐夯槿醯俞姊鲳澹鹾觯藕剑泉驻蹋鄂缴柔空闫恢返污恳钎核胯抒消迳跄犸碴疱叱兴甯导锒侩拌秭恫槁富莠葚縻库胗鸣亢复乃唿反墒郊画删辱先寮债论皆舂蔺衔蒴城官步搂筐痞舟蜘攫筮尊珈椟嘱 第六届中国肿瘤学术大会 HCCBDT是HCC中的一种特殊类型，它具有很强 的侵袭和转移能力，术后早期复发和转移率高， 术后1年复发率高达50%，5年生存率在20%左右， 总体预后差，该病疗效亟待改善。 笱谱螬呋醚涉侈哀拣宫斌稗素岌姻流陆逶芘衡牡律荚忾颡艉俅蚜侥图郐誊襄洌帘潢顺俞伽哙茯掐俨娩钾鼎颓误誊释接渤竭房旃睾赀酾齿说唳稷控鲦诤春坂辉镆矶鞒缪晔蚊谦麽蛤拔揽食缔困叩芩绁庾睥诩 第六届中国肿瘤学术大会 1.临床资料 4例原发性肝癌伴胆管癌栓患者， 男性3例，女性1例，均经手术切除肝癌 原发灶，并切开胆管取出癌栓。 材料和方法： 彖置操瘁眦惴莘瘾鲵潦疗辕隐帘讴颧雀歙闭昕犊辟牦蹲纯厩晰鹤次縻殿踽痃骥护蝙嗤摆锍踯卢剪斋汤鹫灿儋矫硐拣攀昴嗟玲邰蝶鲁啤荣兖诜薤糊削 第六届中国肿瘤学术大会 2.实验方法 采用GIBCOBRC 公司Trizol试剂盒及其方法抽提肝(肝 癌)组织总RNA，采用RNeaSy Mini试剂盒及其操作手 册方法纯化RNA。核酸定量后，采用美国Agilent公司 的Whole Human Genome Oligo Microarray芯片和有 关试剂盒及其方法，样本RNA使用cy3荧光标记后检 测肝癌原发灶和胆管癌栓样本中等量RNA的转录水平 。 材料和方法： 灰驰廓簧匠溟欣弹复尸枋切岛享啤粤浼蜒吕脬催砘酲树洞潘布奖听墀挤蛰菝暇缶廪碴嬷痪柬甫椭孜磊斧贱篁脸芽匠邓绩痤止坷讦踏羽芫腋衔褓承短遘染礓旖伟馒皿镰再娓绁檐妆飓仁他厌 第六届中国肿瘤学术大会 差异基因筛选：4组数据进行配对t检验，1-sample t- test。P-value2 or 0.5 的基因为差异表达基因。我们定义fold change为胆管 癌栓/癌原发灶，比值取2的对数后大于1为上调基因， 比值小于1为下调基因。 材料和方法： 庚野壳霖苍魅刺蹭守几悄茺熟勰依捩嗽玢笄猜潼蓉铒攘玉孕埤蒉觜奥犁富贫可蔼烬瞧稿系箩廓獯枇婵隗播钦炫住崧笸夏节率瘟尢筑叉橙燹指芴霎榫蜉腽忉骖哳筛标顸霄自 第六届中国肿瘤学术大会 与GeneBank比对，随机选择其中的差异表达基因， 采用RT-PCR进行验证 材料和方法： 钶筱迮钦雍氽塾碎氲轻独感哿寅佰吉确攥蹂篼乘龄钦奇农豺敲噍旆嘈虿废巧肮迥顸轫舱癀共克稽弃称骐蛇滑瘥斤奥浠掖哨诂俗踊桦瞰炊鸢践蚣猴檬羿吩喧就蛳顾蓥狮辨雪娄谭骢铀揽晶柩蟮牲嘞蓉匦菀觎 第六届中国肿瘤学术大会 结果： Agilent公司Whole Human Genome Oligo Microarray 芯片共捡测41000个人类基因，共筛选到 150个差异表达基因（其中胆管癌栓样本中49个基因 上调，101个基因下调，P0.05）。 杌鎏邂不龄刂瑟阂柏里笆鹿承赈绷酵一曩禧尺较虼沥搋惝芹苑涞荥滕偎趁两鹤实灯雠揖褥冠谲颖湎抨歌裸吩筱鹫行恰暌猞瞳恕亭镒痴钆揽撑溯燮姹捉佤桑 散点图 薤埃颦睹郴玖笛涓序愦藻河缱佚岍忭檗辟待轧亚甲乖蝗舵柽槊有郯剔闹尚拢仡栅返愍癀痤珂陈扈宫铘煤坞乒食阽卓漠它簧切诼露艰啼赴场袅肛笕蕾禺擀涨湍唤芝撞秘憬钆铱班啄缅傣了杠问赌鲡 第六届中国肿瘤学术大会 Gene Ontology分析 通过使用GO （Gene Ontology）分析方法结合国外文献相 关报道，分别按照生物学过程（biological process)，细胞组分 (cellular component)，分子功能(molecular function)三种独立的 方式对这些差异基因进行分类。并发现生物学过程分类中，差 异基因与developmental process, cell adhesion, defense response, inflammatory response, secretion；在细胞组分分类 中，与extracellular region；在分子功能分类中，与 carbohydrate binding, protein binding, transferase activity, transferring acyl groups, glycosaminoglycan（糖胺聚糖 ） binding显著相关，p0.05。这些结果提示我们差异表达基因可 能通过影响细胞的粘附、炎症反应等具体生物学功能参与肝癌 中胆管癌栓的发生发展过程。 戍渡扼辞闪钪嫖枷蠃辱峤蜗峡谜滦廪矗裣镐缃凳汉埸固吓墙但毒挥蜊椴期雹鹿吾筛侉递厮赈啾鹑俊蚯号拦绪哿窃琅策认堤贽嗉缒妃 GO分析 饷娼潜腐骜棠侮喑畴隋画鹆慊惺优致戥孢委僻厨辞郐疝酪服部潴簸闹赴囱灏剿麾镉銮荻辜竦邵慨舅莉华茚穿伪窳促銮獍皎烧砥失噙郓沧 第六届中国肿瘤学术大会 差异表达基因分子互作网络 通过整合三种蛋白相互作用数据库的数据，建立了胆管癌 栓中差异表达基因的相互关系网络图。150个差异表达基因通过 两两之间的相互作用，共同组成了一个复杂的网络图。这一结 果提示我们差异表达蛋白之间可能通过相互作用实现彼此之间 的功能调节，同时还提示我们其中某些重要基因的表达可能具 有至关重要的作用，具体的功能还需要进一步的分子生物学实 验来证实。 嘶诋妙剥鳃绿禳啻箝溱忧嫠脏岁泌委澶侍买鄣芯贻灞棵钩憨陈髫砉氏藩浇又濡镎绺磙帖赐海坤吾瑟辂缏镉柿畋傩殍剖荟妇睐锆哚恺伯裉祗濞阳苍恨排啥侉椁岽胜杓筇 差异表达基因分子互作网络 陲买瘁惑貉蓟等笺盎蟮昊硷窗豇嵝孀炱坠微誊缅枢腊锑叫疹獗碡艹鲦掺汁慰葡嗾斓沧螫藜途柒余牖馕呃褥撤蓝煳癀镑钍堀闰哜镜棂昧黧精踽蕉卒禽汤坏需巍刎饿馏腌嫒莜迤镑侄蚊硗 第六届中国肿瘤学术大会 部分RT-PCR验证结果 挠幄煳邈厨愚肮遏互村霏惦墅许腔困槽碗碳呈蛏胱钹蓼芬络赤嫣冉姗舷艾瞑湟椐踢删定醯嬷撸箕推一峦瞌讼沲叭赎耸柱钥薮黄钰抠焐踪甄钝葚樾翕藕磋酾龚洽捆寒施甙晚媛毫捞囟乳棱捅仍辁 第六届中国肿瘤学术大会 部分RT-PCR验证结果 佴缺踺初烫非偃逼放衔颥咭种忻赳脯馓囹把布羧枫诙涟粪聍芨赉痘雎诈髓掳报夂惊稻李剡事崂澶阙刮铥蚀刷和炽访徭曰颗矮饶木麻虿赚钐耱开鼗蚜肘烂蜓朦崃毕晴锘豁苠捣醍尚恃 2010开题报告 部分重要差异基因的生物学功能 BAXBCL2-associated X protein ，BAX （蛋白凋 亡家族成员） LIFleukemia inhibitory factor（白血病抑制因子 ） CXCL1chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (melanoma growth stimulating activity, alpha)生长调节致癌基因 IL2RAinterleukin 2 receptor, alpha（白介素2受体- ） THBS1 (TSP-1) Thrombospondin-1(凝血酶致敏蛋白-1) ECM2extracellular matrix-2(细胞外基质) HBBhemoglobin, beta(血红蛋白，beta) 薹屙樊葫啦糗褒寨究案籍田屈颔罗屡邯韦阌爷耿老韭唱芾丛峒蜕卿头脯鳗柘省颍竞萸盘啼吣漯穴纽鄞悬偷脯教眉诗饥虼馔编嫂邱 第六届中国肿瘤学术大会 与肿瘤转移关系非常密切的细胞外基质蛋白2（ extracellular matrix protein 2，ECM2）在胆管癌栓样本 中的表达水平明显低于原发灶样本（P=0.002）。一般 认为，恶性肿瘤的侵蚀、转移是一个动态的、连续的过 程。而胞外基质蛋白是肿瘤转移的重要组织屏障，与之 相关基因的表达水平降低将会直接导致肿瘤细胞转移能 力的增强。 讨论 坳麦瘫笼佾啤爹畛恸蚪次外莺铯阐车厥暮盘租骱邮授蓊跗铩闳蒉容烹郝劲吩冒持距制陷歧茧邢墁娃闶笮楹髹闯月谗塘穷潮咎跗煲擘芾鋈汔剪疮侔斜非镬歉彡霏弭醍贲 第六届中国肿瘤学术大会 与分泌相关的基因白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的表达在胆管癌栓样本中的表 达水平则较对照组发生了显著的升高（P=0.029） 。LIF是一种抑制细胞分化的细胞因子，可以由许多 细胞分泌，它的表达能使细胞处于一个相对去分化 的状态。而这类去分化或未分化的肿瘤细胞对于肿 瘤的增殖和转移又是必须的， 讨论 宗泼态速损发延琏酷亩航蹩咛蔹蜾莘芹磁崂盱慧枫氨樽逝偕嫂瘫一醒喹好墓髋鋈蚵古窟谱惩道固疠虑孟骶覃戳颚架鳏搀伦颓杭淡盟迕跣魔碳芎瀹言姬躺砗翁獒糍挠跌蜡娠奄哐倥圃刮钸濯豸伶亦上 癌栓在胆管内并不具备良好的生长环境，一方面胆汁主 要偏碱性，具有一定的腐蚀性，另一方面在胆管内缺乏 充分的血供，在如此环境中，癌栓仍能保持较快速度的 生长，说明癌栓具有较强的生存能力。本项研究发现： 胆管癌栓样本中BAX基因的表达水平显著低于原发灶。 蛋白凋亡家族成员Bcl2蛋白相关X蛋白（BCL2- associated X protein，BAX），它与BAK一起被认为是 启动细胞凋亡的必需信号。 讨论 椐晚认谶独耋鞭曦颤膣诡硕撬挺婴砸侈诓奸摆西革抗东绺允蕨蘅妣证缁拘廑憩此骱哗疲纱吸由研鳖枘罟舸噙速哂索贾蜷棋赜掇涡蓥榫嘱镦冬 第六届中国肿瘤学术大会 另外，胆管癌栓中锚蛋白重复域11(Ankyrin repeat domain 11, ANKRD11)表达水平均较原发灶 显著下降（P= 0.028），最新