接种分离纯化和培养技术ppt课件

第四章 接种、分离纯化和 培养技术 第一节 培养基制备技术 第二节 接种、分离纯化和培 养技术 第三节 常用的微生物培养基 原理、制作和现 象（自学） 第一节 培养基制备技术 一、玻璃器皿的清洗 在制备培养基的过程中，首先要使用一些 玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿、烧杯 和吸管等。这些器皿在使用前都要根据不同 的情况，经过一定的处理，洗刷干净。有的 还要进行包装，经过灭菌等准备就绪后，才 能使用。 二、培养基的类型 在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或 累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基 （Media）。由于各类微生物对营养的要求不 同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的 种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多 的培养基划分为若干类型。 1、根据对培养基组成物质的化学成分是 否完全了解来区分，可以将培养基分 为 天然培养基、 合成培养基、 半合成培养基。 天然培养基是指利用各种动、植物或微生 物的原料，其成分难以确切知道。用作这种培 养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨 、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯 、牛奶、血清等。用这些物质配成的培养基虽 然不能确切知道它的化学成分，但一般来讲， 营养是比较丰富的，微生物生长旺盛，而且来 源广泛，配制方便，所以较为常用，尤其适合 于配制实验室常用的培养基。这种培养基的稳 定性常受生产厂或批号等因素的影响。 1）天然培养基 2）合成培养基 合成培养基是一类化学成分和数量完全知 道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品 配制而成。这类培养基化学成分精确、重复性 强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以 它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢 的研究。 3）半合成培养基 在合成培养基中，加入某种或几种天然成 分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已 知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马 铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和 实验室中使用最多。 2、根据培养基的物理状态来区分，可以 分为： 固体培养基、 液体培养基 半固体培养基。 3、根据培养基的用途来区分，可分为： 选择培养基、 增殖培养基、 鉴别培养基等。 三、培养基制备的基本方法和注意事项 1、培养基配方的选定 同一种培养基的配方在不同著作中常会有 某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严 格按其规定进行配制外，一般均应尽量收集有 关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目 的，加以选用，记录其来源。 2、培养基的制备记录 每次制备培养基均应有记录，包括培养基 名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最 终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备 者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复 制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混 乱。 3、培养基成分的称取 培养基的各种成分必须精确称取并要注意 防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配 方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上做出 记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左 侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称 取完毕后，还应进行一次检查。 4、培养基各成份的混合和溶化 培养基所用化学药品均应是化学纯的。使 用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量 铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最 好使用不锈钢加热溶化，可放入大烧杯或大 烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器 中蒸煮溶化。 5、培养基pH的初步调正 因培养基在加热消毒过程中、pH会有所 变化，培养基各成分完全溶解后，应进行pH 的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低 pH 0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。因此， 对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、 以期能掌握培养基的最终pH，保证培养基的 质量。pH调整后，还应将培养基煮沸数分钟 ，以利培养基沉淀物的析出。 6、培养基的过滤澄清 液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也 应透明无显著沉淀，因此，须要采用过滤或其 它澄清方法以达到此项要求。一般液体培养基 可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形 ，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。 琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过 滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过 滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先 用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过 滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。 即将冷却至5560的培养基放入大的三角烧 瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的1/2，每 1000ml培养基加入12个鸡蛋的蛋白，强力振 摇35分钟，置高压蒸汽灭菌器中、121加热 20分钟、取出趁热以绒布过滤即可。 7、培养基的分装 培养基的分装，应按使用的目的和要求， 分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得 超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿 纸的棉塞封堵，其外还须用防水纸包扎（现试 管一般多有用螺旋盖者）。分装时最好能使用 半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培 养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面 的量为洽当。 分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒， 以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另 外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批 培养基同时灭菌，以为测定该批培养基最终 pH之用。 8、培养基的灭菌 一般培养基可采用121高压蒸汽灭菌15 分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如 无特殊规定，即可用此法灭菌。 某些畏热成分，如糖类，应另行配成20% 或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以 后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶 培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗 生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷 却约50左右的培养基中。 琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷 至55-60时，摆置成适当斜面，待其自然 凝固。 9、培养基的质量测试 每批培养基制备好以后，应仔细检查一 遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉 塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定 其最终pH。 将全部培养基放入361恒温箱培养过 夜，如发现有菌生长，即弃去。 用有关的标准菌株接种12管或瓶培养基， 培养2448小时，如无菌生长或生长不好。应 追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则 该批培养基即应弃去，不能使用。 10、培养基的保存 培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通 冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板 培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有 该批培养基制备记录副页或明显标签。 第二节 接种、分离纯化和培养技术 一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培 养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 1、接种工具和方法 在实验室或工厂实践中，用得最多的接种 工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法 的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状， 有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作 为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面 要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。 接种和分离工具 1.接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： 1）划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养 基表面作来回直线形的移动，就可达到接种 的作用。常用的接种工具有接种环，接种针 等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 2）三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少 量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形 的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、 研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点 进行接种的。 3）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常 采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接 种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的 做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体 培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有 鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 4）浇混接种 该法是将待接的微生物先放入培养皿中， 然后再倒入冷却至45左右的固体培养基，迅 速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待 平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出 单个的微生物菌落。 5）涂布接种 与浇混接种略有不同，就是先倒好平板， 让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速 用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均 匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 6）液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养 基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液 接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液 移至固体培养基中，都可称为液体接种。 7）注射接种 该法是用注射的方法将待接的微生物转接 至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的 疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体， 来预防某些疾病。 8）活体接种 活体接种是专门用于培养病毒或其它病原 微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的 生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整 个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾 等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射 ，也可以是拌料喂养。 2、无菌操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工 具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种 含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培 养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实 验室检验中的各种接种必须是无菌操作。 实验台面不论是什么材料，一律要求光滑、 水平。光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼 脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致 。在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽 量减少，其周围杂菌也应越少越好。为此，必 须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂 进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量 。 斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞 二、分离纯化 含有一种以上的微生物培养物称为混和培 养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所 有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落 称为纯培养（Pure culture）。在进行菌种鉴 定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物 。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许 多种。 1、倾注平板法 首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定 量的稀释液与熔化好的保持在4050左右的营 养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到 无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在 恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个 菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次 ，便可得到纯培养物。 2、涂布平板法 首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一 定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂 平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀 地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得 到单个菌落。 1、倾注平板法 2、涂布平板法 操作较麻烦， 对好氧菌、热 敏感菌效果不 好！ 使用较多的常规 方法，但有时涂 布不均匀！ 3、平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法。 用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线 。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌 落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射 法、四格法等。当接种环在培养基表面上往后移 动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的 线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成 一个菌落。 平板划线分离法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法 三、培养 微生物的生长，除了受本身的遗传特性决 定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物 浓度、温度、水分、氧气、等。微生物的 种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。 2、培养方法 1）根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养 和厌氧培养两大类。 好氧培养：也称“好气培养”。就是说这种 微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不 能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过棉 花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培 养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不 断地进入瓶中。 厌氧培养：也称“厌气培养”。这类微生物 在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物 的培养过程中，最重要的一点就是要除去培 养基中的氧气。一般可采用下列几种方法： a. 降低培养基中的氧化还原电位：常将还 原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，加入到培养 基中，便可达到目的。有的将一些动物的死的 或活的组织如牛心、羊脑加入到培养基中，也 可适合厌氧菌的生长。 b. 化合去氧：这也有很多方法，主要有： 用焦性没食子酸吸收氧气；用磷吸收氧气；用 好氧菌与厌氧混合培养吸收氧气；用植物组织 如发芽的种子吸收氧气；用产生氢气与氧化合 的方法除氧。 c. 隔绝阻氧：深层液体培养；用石蜡油封 存；半固体穿刺培养。 d. 替代驱氧：用二氧气碳驱代氧气；用氮 气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧 气；用混和气体驱代氧气。 第三节 常用的微生物培养基 原理、制作和现象 牛肉膏 5g 蛋白胨 10g 氯化钠 3g 磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O) 2g 0.2%滇麝香草酚蓝溶液 12mL 蒸馏水 1000mL pH7.4 1、糖发酵管 1）成分 2）制法 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按 0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的 小试管内，121高压灭菌15min。 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后 ，分装每瓶100mL，121高压灭菌15 min 。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高 压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基 内，以无菌操作分装小试管。 注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者， 应采用过滤法除菌。 3）试验方法 从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于 361培养，一般观察23d。迟缓反应需 观察1430d。 2、ONPG培养基 1）成分 邻硝基酚D-半乳糖昔(ONPG) 60mg (O-Nitrophenyl-D-galactopyranoside) 0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5) 10mL 1%蛋白胨水(PH7.5) 30mL 2）制法 将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水， 以过滤法除菌，分装于10mm75mm试管，每 管0.5mL，用橡皮塞塞紧。 自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种，于 361培养13h和24h观察结果。如果-半 乳糖苷酶产生，则于13h变黄色，如无此酶 则24h不变色。 3）试验方法 3、缓冲葡萄糖蛋白胨水 （MR和VP试验用） 1）成分 磷酸氢二钾 5g 蛋白胨 7g 葡萄糖 5g 蒸馏水 1000mL pH7.0 2）制法 3）甲基红(MR)试验 溶化后校正pH，分装试管，每管1mL， 121高压灭菌15min。 自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基 中，于361培养25d，哈夫尼亚菌则应在 2225培养。滴加甲基红试剂一滴，立即观 察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。甲基红 试剂配法：10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中 ，然后加入20mL蒸馏水。 4）V-P试验 用琼脂培养物接种本培养基中，于361 培养24d。哈夫尼亚菌则应在2225培养 。加入6%-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧 化钾溶液0.2mL，充分振摇试管，观察结果。 阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴 性，应放在361下培养4h再进行观察。 4、西蒙氏柠檬酸盐培养基 1）成分 氯化钠 5g 硫酸镁(MgSO47H2O) 0.2g 磷酸二氢铵 1g 磷酸氢二钾 1g 柠檬酸钠 5g 琼脂 20g 蒸馏水 1000mL 0.2%溴麝香草酚蓝溶液 40mL pH6.8 2）制法 3）试验方法 先将盐类溶解于水内，校正pH，再加琼脂， 加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后分装试 管，121高压灭菌15min。放成斜面。 挑取少量琼脂培养物接种，于361培养 4d，每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长 ，培养基从绿色转为蓝色。 5、克氏柠檬酸盐培养基 1）成分 柠檬酸钠 3g 葡萄糖 0.2g 酵母浸膏 0.5g 单盐酸半胱氨酸 0.1g 磷酸二氢钾 1g 氯化钠 5g 0.2%酚红溶液 6mL 琼脂 15g 蒸馏水 1000mL 2）制法 3）试验方法 加热溶解，分装试管，121高压灭菌 15min。放成斜面。 用琼脂培养物接种整个斜面，在361 培养7d，每天观察结果。阳性者培养基变为 红色。 6、丙二酸钠培养基 1）成分 酵母浸膏 1g 硫酸铵 2g 磷酸氢二钾 0.6g 磷酸二氢钾 0.4g 氯化钠 2g 丙二酸钠 3g 0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12mL 蒸馏水 1000mL pH6.8 2）制法 3）试验方法 先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正pH后再 加入指示剂，分装试管，121高压灭菌15min 。 用新鲜的琼脂培养物接种，于361培养 48h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。 7、葡葡糖铵培养基 1）成分 氯化钠 5g 硫酸镁(MgSO47H2O) 0.2g 磷酸二氢铵 1g 磷酸氢二钾 1g 葡萄糖 2g 琼脂 20g 蒸馏水 1000mL 0.2%溴麝香草酚蓝溶液 40mL pH6.8 2）制法 先将盐类和糖溶解于水内，校正pH，再加 琼脂，加热溶化，然后加入指示剂，混合均匀 后分装试管，121高压灭菌15min，放成斜 面。 注：容器使用前应用清洁液浸泡。再用 清水、蒸馏水冲洗干净，并用新棉花做成棉 塞，干热灭菌后使用。如果操作时不注意， 有杂质污染时，易造成假阳性的结果。 3）试验方法 用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水 管内做成极稀的悬液，肉眼观察不见混浊，以 每一接种环内含菌数在20100之间为宜。将 接种环灭菌后挑取菌液接种，同时再以同法接 种普通斜面一支作为对照。于361培养24h 。阳性者葡萄糖铵斜面上有正常大小的菌落生 长；阴性者不生长，但在对照培养基上生长良 好。如在葡萄糖铵斜面生长极微小的菌落可视 为阴性结果。 8、Hugh-Leifson培养基(O/F试验用) 1）成分 蛋白胨 2g 氯化钠 5g 磷酸氢二钾 0.3g 琼脂 4g 葡萄糖 10g 0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12mL 蒸馏水 1000mL pH7.2 2）制法 将蛋白胨和盐类加水溶解后，校正pH至7.2 。加入葡萄糖、琼脂煮沸，溶化琼脂，然后加入 指示剂。混匀后，分装试管，121高压灭菌 15min，直立凝固备用。 3）试验方法 从斜面上挑取小量培养物作穿刺接种，同时 接种两支培养基，其中一支于接种后滴加溶化 的1%琼脂液于表面，高度约1cm，于361培 养。 9、马尿酸钠培养基 1）成分 马尿酸钠 1g 肉浸液 100mL 2）制法 将马尿酸钠溶解于肉浸液内，分装于小试 管内，并于管壁画一横线。以标志管内液面高 度，高压灭菌12120min。 3）试剂 三氯化铁(FeCl36H2O)12g，溶于2%盐酸 溶液100mL中即成。 4）试验方法 用纯培养物接种，于42培养48h，观察 培养液是否到达试管壁上记号处，如不足时， 用蒸馏水补足至原量。经离心沉淀，吸取上清 液0.8mL，加入三氯化铁试剂0.2mL，立即混 合均匀，经1015min，观察结果。 出现恒久之沉淀物为阳性。 5）结果 10、营养明胶 1）成分 蛋白胨 5g 牛肉膏 3g 明胶 120g 蒸馏水 1000mL pH6.87.0 2）制法 加热溶解、校正至pH7.47.6，分装小管， 121高压灭菌10min，取出后迅速冷却，使其 凝固。复查最终pH应为6.87.0。 3）试验方法 用琼脂培养物穿刺接种，放在2225培 养，每天观察结果，记录液化时间。或放在 361培养，每天取出，放冰箱内30min后再 观察结果。 11、苯丙氨酸培养基 1）成分 酵母浸膏 3g DI-苯丙氨酸(或L苯丙氨酸1g) 2g 磷酸氢二钠 1g 氯化钠 5g 琼脂 12g 蒸馏水 1000mL 2）制法 3）试验方法 加热溶解后分装试管，121高压灭菌 15min，使成斜面。 自琼脂斜面上挑取大量培养物，移种于苯 丙氨酸琼脂，在361培养4h或1824h。滴 加10%三氯化铁溶液23滴，自斜面培养物上 流下，苯丙氨酸脱氨酶阳性者呈深绿色。 12、氨基酸脱羧酶试验培养基 1）成分 蛋白胨 5g 酵母浸膏 3g 葡萄糖 1g 蒸馏水 1000mL 1.6%滇甲酚紫-乙醇溶液 1mL L-氨基酸或DL-氨基酸 0.5或1g/100mL pH6.8 2）制法 除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每 瓶100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精 氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨 基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。对照培养 基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管 0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115高压灭 菌10min。 3）试验方法 从琼脂斜面上挑取培养物接种，于361 培养1824h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性 者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性 产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。 对照管应为黄色。 13、蛋白胨水(靛基质试验用) 1）成分 蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000mL pH7.4 2）制法 按上述成分配制，分装小试管，121 高压灭菌15min。 3）靛基质试剂 柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解 于75mL戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸25mL。 欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于 95mL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL 。 4）试验方法 挑取小量培养物接种，在361培养1 2d，必要时可培养45d。加入柯凡克试剂约 0.5mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色 ；或加入欧-波试剂约0.5mL，沿管壁流下，覆 盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰 红色。 注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批 蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使 用。 14、硫酸亚铁琼脂(硫化氢试验用) 1）成分 牛肉膏 3g 酵母浸膏 3g 蛋白胨 10g 硫酸亚铁 0.2g 硫代硫酸钠 0.3g 氯化钠 5g 琼脂 12g 蒸馏水 1000mL pH7.4 2）制法 3）试验方法 加热溶解，校正pH，分装试管，115 高压灭菌15min，取出直立候其凝固。 挑取琼脂培养物，沿管壁穿刺，于361培 养12d，观察结果。产硫化氢者使培养基变为 黑色。 注：肠杆菌科细菌测定硫化氢的产生，应采 用三糖铁琼脂或本培养基。 15、尿素琼脂 1）成分 蛋白胨 1g 氯化钠 5g 葡萄糖 1g 磷酸二氢钾 2g 0.4%酚红溶液 3mL 琼脂 20g 蒸馏水 1000mL 20%尿素溶液 100mL pH7.20.1 2）制法 将除尿素和琼脂以外的成分配好，并校正 pH，加入琼脂，加热溶化并分装烧瓶。121 高压灭菌15min。冷至5055，加入经除菌 过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%，最终 pH应为7.20.1。分装于灭菌试管内，放成斜 面备用。 3）试验方法 挑取琼脂培养物接种，在361培养 24h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而 使培养基变为红色。 16、氰化钾(KCN)培养基 1）成分 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 磷酸二氢钾 0.225g 磷酸氢二钠 5.64g 蒸馏水 1000mL 0.5%氰化钾溶液 20mL pH7.6 2）制法 将除氰化钾以外的成分配好后分装烧瓶， 121高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分 冷却。每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液 2.0mL(最后浓度为110000)，分装于 12mm100mm灭菌试管，每管约4mL，立刻 用灭菌橡皮塞塞紧，放在4冰箱内，至少可 保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作 为对照培养基，分装试管备用。 3）试验方法 将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释 菌液，挑取1环接种于氰化钾(KCN)培养基。 并另挑取1环接种于对照培养基。在361培 养12d，观察结果。如有细菌生长即为阳性 (不抑制)，经2d细菌不生长为阴性(抑制)。 注：氰化钾是剧毒药物，使用时应小心， 切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰 箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严， 氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致 药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反 应。试验时对每一环节都要特别注意。 17、硝酸盐培养基 1）成分 硝酸钾 0.2g 蛋白胨 5g 蒸馏水 1000mL pH7.4 2）制法 溶解，校正pH，分装试管，每管约5mL， 121高压灭菌15min。 硝酸盐还原试剂 甲液：将对氨基苯磺酸0.8g溶解于 2.5mol/L乙酸溶液100mL中。 乙液：将甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸 溶液100mL中。 接种后在361培养14d，加入甲液和乙 液各一滴，观察结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐 时于立刻或数分钟内显红色。 注：本试验阴性的原因有三：细菌不能还 原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮； 培养基不适于细菌的生长。如欲检查培养基中 硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可 使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。 3）试验方法 18、氧化酶试验 1）试剂 1%盐酸二甲基对苯二胺溶液：少量新鲜配 制，干冰箱内避光保存。 1%-萘酚乙醇溶液。 2）试验方法 取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对 苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐 加深；再加-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟 内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。 以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上， 其显色反应与以上相同。 19、细胞色素氧化酶试验 1）试剂 1%盐酸二甲基对苯二胺溶液：少量新鲜配 制，干冰箱内避光保存。 1%-萘酚乙醇溶液。 2）试验方法 取37(或低于37)培养20h的斜面培养 物一支，将两种试剂各23滴，从斜面上端滴 下，并将斜面略加倾斜，使试剂混合液流经斜 面上的培养物。如系平板培养物，则可用试剂 混合液滴在菌落上。 3）结果 于2min内呈现蓝色者为阳性。阳性培养物 大多数于半分钟内出现强阳性反应，2min以 后出现微弱或可疑反应均作为阴性结果。 20、过氧化氢酶试验 1）试剂 3%过氧化氢溶液：临用时配制。 2）试验方法 挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试 管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。 3）结果 于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生 气泡者为阴性。 21、过氧化物酶试验 1）试剂 2）试验方法 2%儿茶酚溶液。 3%过氧化氢溶液。 挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁 净试管内，滴加2%儿茶酚溶液1mL及3%过氧 化氢溶液1mL。静置于室温(20)中30 60min，观察结果。 3）结果 阳性反应，细菌变为黑褐色；阴性反应， 细菌不变色。 注：过氧化物酶的作用可受氰化钾的抑 制。 22、磷酸盐缓冲液 1）储存液 磷酸二氢钾 34g 1mol/L氢氧化钠溶液 175mL 蒸馏水 825mL pH7.2 2）制法 先将磷酸盐溶解于500mL蒸馏水中，用 1mol/L氢氧化钠溶液校正pH后，再用蒸馏水 稀释至1000mL。 3）稀释液 取储存液1.25mL，用蒸馏水稀释至 1000mL。分装每瓶100mL或每管10mL， 121高压灭菌15min。 23、明胶磷酸盐缓冲液 1）成分 明胶 2g 磷酸氢二钠 4g 蒸馏水 1000mL pH6.2 2）制法 加热溶解，校正pH，121高压灭菌 15min。 24、乳酸苯酚溶液 （检验真菌形态用） 1）成分 2）制法 苯酚 10g 乳酸(比重1.21) 10g 甘油 20g 蒸馏水 10mL 将苯酚在水中加热溶解，然后加入乳酸及 甘油。 25、肉浸液肉汤 1）成分 绞碎牛肉 500g 氯化钠 5g 蛋白胨 10g 磷酸氢二钾 2g 蒸馏水 1000mL 2）制法 将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g加蒸馏水 1000mL，混合后放冰箱过夜，除去液面之浮 油，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块， 用绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水补足 原量。加入蛋白胨、氯化钠和磷酸盐，溶解后 校正pH7.47.6煮沸并过滤，分装烧瓶， 121高压灭菌30min。 26、肉浸液琼脂 1）成分 2）制法 肉浸液肉汤(PH7.4) 1000mL 琼脂 1720g 加热溶化琼脂，分装烧瓶或试管，121 高压灭菌30min。根据需要，倾注平板或放成 斜面。 27、牛肉(或牛心)消化汤 1）成分 绞碎牛肉(或牛心) 1000g 15%氢氧化钠溶液 27mL 胰蛋白酶 40mL 三氯甲烷 1mL 氯化钠 10g 蒸馏水 2000mL 2）制法 称取碎牛肉，加蒸馏水，隔水加热到 80，维持15min。 加氢氧化钠溶液，对pH试纸呈弱碱性， 冷至40。 加胰蛋白酶、氯仿，在361放置4 5h，每小时摇动一二次。 4h后，吸取上层液5mL于试管中，加 5%硫酸铜溶液0.1mL、4%氢氧化钠溶液5mL ，混合之。若呈红色，则不须再消化，可由温 箱取出。 加入15%乙酸溶液45mL，对pH试纸呈 酸性。 煮沸15min，使胰蛋白酶破坏，冷后， 放冰箱内一夜。 次日吸取上层清液，加氯化钠10g，并 加水补足原量，煮沸。 校正pH7.47.6(加15%氢氧化钠溶液 约10mL)，加热，用滤纸过滤，分装烧瓶， 121高压灭菌20min。 注： 此培养基可作为琼脂培养基的基础，不 需加蛋白胨。 胰蛋白酶之配制：称取去脂绞碎的猪胰 500g，加入乙醇500mL、蒸馏水1500mL，混 合之，装人玻塞瓶内。每日摇匀三次。3d后， 用绒布过滤挤出其汁，加盐酸至0.05%，放冰 箱内保存备用。 28、血消化汤 1）成分 绞碎猪胃 100g 绞碎猪血块 100g 蒸馏水 1000mL 浓盐酸 10mL 2）制法 洗涤猪胃，除去油脂，保留胃粘膜，用 绞肉机绞碎。 用绞肉机将猪血块绞碎。 将蒸馏水加热至55，加入猪胃、猪血 块和盐酸，置55水浴中24h，时常加以摇动。 从水浴内取出，加入1moL/L碳酸钠溶液 5mL，煮沸10min，置于冰箱内一夜。 吸取上层清液，加磷酸氢二钾1g，加 热至75，加入1mol/L碳酸钠溶液45mL，煮 沸，校正pH7.27.4。 用滤纸过滤，分装烧瓶，121高压灭 菌20min。 注： 本培养基不含糖可供作鉴别培养基之基 础，不需加蛋白胨和氯化钠。 1mol/L碳酸钠溶液之配法：无水碳酸钠 10.6g，溶于1000mL蒸馏水中。 29、豆粉琼脂 1）成分 牛心消化汤(PH7.47.6) 1000mL 琼脂 20g 黄豆粉浸液 50mL 将琼脂加在牛心消化汤内，加热溶解，过 滤。加入豌豆粉浸液，分装每瓶100mL， 121高压灭菌15min。 豌豆粉浸液制法：取豌豆粉5g、氯化钠 10g，加入蒸馏水100mL。置100水浴内加 热1h，放于冰箱中过夜。吸取上清液即为豌豆 浸液。 2）制法 30、血琼脂 1）成分 2）制法 pH7.47.6豆粉琼脂 100mL 脱纤维羊血(或兔血) 510mL 加热溶化琼脂，冷至50，以灭菌手续加 入脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。亦可分装灭 菌试管，置成斜面。亦可用其他营养丰富的基 础培养基配制血琼脂。 31、营养琼脂 1）成分 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 5g 琼脂 1520g 蒸馏水 1000mL 2）制法 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内， 加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2 7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。 分装烧瓶，121高压灭菌15min。 注：此培养基可供一般细菌培养之用，可 倾注平板或制成斜面。如用于菌落计数，琼脂 量为1.5%；如作成平板或斜面，则应为2%。 32、营养肉汤 1）成分 2）制法 蛋白陈 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000mL pH7.4 按上述成分混合，溶解后校正pH，分装烧 瓶，每瓶225mL，121高压灭菌15min。 33、乳糖胆盐发酵管 1）成分 蛋白胨 20g 猪胆盐(或牛、羊胆盐) 5g 乳糖 10g 0.04%滇甲酚紫水溶液 25mL 蒸馏水 1000mL pH7.4 2）制法 将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH， 加入指示剂，分装每管10mL，并放入一个小倒 管，115高压灭菌15min。 注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他 成分加倍。 34、乳糖发酵管 1）成分 蛋白胨 20g 乳糖 10g 0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL 蒸馏水 1000mL pH7.4 2）制法 将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入 指示剂，按检验要求分装30mL、10mL或3mL ，并放入一个小倒管，115高压灭菌15min 。 注：双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他 成分加倍。 30mL和10mL乳糖发酵管专供酱油及酱 类检验用，3mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试 验用。 35、EC肉汤 1）成分 胰蛋白胨 20g 3号胆盐(或混合胆盐) 1.5g 乳糖 5g 磷酸氢二钾 4g 磷酸二氢钾 1.5g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000mL 2）制法 将上述成分混合，溶解后，分装有发酵倒 管的试管中，121高压灭菌15min，最终pH 为6.90.2。 36、缓冲蛋白胨水(BP) 1）成分 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O) 9g 磷酸二氢钾 1.5g 蒸馏水 1000mL pH7.2 2）制法 按上述成分配好后以大烧瓶装，121高 压灭菌15min。临用时无菌分装每瓶225mL。 注：本培养基供沙门氏菌前增菌用。 37、氯化镁孔雀绿增菌液(MM) 1）成分 甲液 胰蛋白胨 5g 氯化钠 8g 磷酸二氢钾 1.6g 蒸馏水 1000mL 乙液 氯化镁(化学纯) 40g 蒸馏水 100mL 丙液 0.4%孔雀绿水溶液。 2）制法 分别按上述成分配好后，121高压灭菌 15min备用。临用时取甲液90mL、乙液9mL 、丙液0.9mL，以无菌操作混合即可。 注：本培养基亦称Rappaport 10(R10)增 菌液。 38、四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB) 1）成分 基础培养基 多胨或脙胨 5g 胆盐 1g 碳酸钙 10g 硫代硫酸钠 30g 蒸馏水 1000mL 碘溶液 碘 6g 碘化钾 5g 蒸馏水 20mL 2）制法 将基础培养基的各成分加入蒸馏水中， 加热溶解，分装每瓶100mL。分装时应随时 振摇，使其中的碳酸钙混匀。121高压灭 菌15min备用。临用时每100mL基础培养基 中加入碘溶液2mL、0.1%煌绿溶液1mL。 39、四硫磺酸钠煌绿增菌液(换用方法) 1）成分 基础液 蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 氯化钠 3g 碳酸钙 45g 蒸馏水 1000mL 将各成分加入于蒸馏水中，加热至约70 溶解，校正pH至7.00.1，121高压灭菌 20min。 硫代硫酸钠溶液 硫代硫酸钠(Na2S2O35H2O) 50g 蒸馏水 加至100mL 碘溶液 碘片 20g 碘化钾 25g 蒸馏水 加至100mL 将碘化钾充分溶解于是少量的蒸馏水中， 加入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解，再加入 蒸馏水至规定量。贮于棕色玻瓶内，紧塞瓶盖 备用。 煌绿水溶液 煌绿 0.5g 蒸馏水 100mL 存放暗处，不少于1d，使其自然灭菌。 牛胆盐溶液 干燥的牛胆盐 10g 蒸馏水 100mL 煮沸溶解，121高压灭菌20min。 2）制法 基础液 900mL 硫代硫酸钠溶液 100mL 碘液 20mL 煌绿溶液 2mL 牛胆盐溶液 50mL 临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加 入于基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后 再加入另一种成分。分装于灭菌瓶中，每瓶 100mL。 40、亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC) 1）成分 蛋白胨 5g 乳糖 4g 亚硒酸氢钠 4g 磷酸氢二钠 5.5g 磷酸二氢钾 4.5g L-胱氨酸 0.01g 蒸馏水 1000mL 1%L-胱氨酸氢氧化钠溶液的配法： 称取L胱氨酸0.1g(或DL胱氨酸0.2g)， 加1mol/L氢氧化钠1.5mL，使溶解，再加入蒸 馏水8.5mL即成。 2）制法 将除亚硒酸氢钠和L胱氨酸以外的各成分 溶解于900mL蒸馏水中，加热煮沸，待冷备用 。另将亚硒酸氢钠溶解于100mL蒸馏水中，加 热煮沸，候冷，以无菌操作与上液混合。再加 入1%L胱氨酸氢氧化钠溶液1mL。分装于 灭菌瓶中，每瓶100mL，pH应为7.00.1。 41、GN增菌液 1）成分 胰蛋白胨 20g 葡萄糖 1g 甘露醇 2g 柠檬酸钠 5g 去氧胆酸钠 0.5g 磷酸氢二钾 4g 磷酸二氢钾 1.5g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000mL pH7.0 2）制法 按上述成分配好，加热使溶解，校正 pH。分装每瓶225mL，115高压灭菌 15min 42、肠道菌增菌肉汤 1）成分 蛋白胨 10g 葡萄糖 5g 牛胆盐 20g 磷酸氢二钠 8g 磷酸二氢钾 2g 煌绿 0.015g 蒸馏水 1000mL pH7.2 2）制法 按上述成分配好，加热使溶解，校正pH。 分装每瓶30mL，115高压灭菌15min。 43、亚硫酸铋琼脂(BS) 1）成分 蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 葡萄糖 5g 硫酸亚铁 0.3g 磷酸氢二钠 4g 煌绿 0.025g 柠檬酸铋铵 2g 亚硫酸钠 6g 琼脂 1820g 蒸馏水 1000mL pH7.5 2）制法 将前面5种成分溶解于300mL蒸馏水中。 将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠另用50mL蒸馏 水溶解。 将琼脂于600mL蒸馏水中煮沸溶解，冷 至80。 将以上三液合并，补充蒸馏水至1000mL ，校正pH，加0.5%煌绿水溶液5mL，摇匀。冷 至5055，倾注平皿。 注：此培养基不需高压灭菌。制备过程不 宜过分加热，以免降低其选择性。应在临用前 一天制备，贮存 于室温暗处。 超过48h不宜使用。 44、DHL琼脂 1）成分 蛋白胨 20g 牛肉膏 3g 乳糖 10g 蔗糖 10g 去氧胆酸钠 1g 硫代硫酸钠 2.3g 柠檬酸钠 1g 柠檬酸铁铵 1g 中性红 0.03g 琼脂 1820g 蒸馏水 1000mL pH7.3 2）制法 将除中性红和琼脂以外的成分溶解于 400mL蒸馏水中，校正pH。再将琼脂于 600mL蒸馏水中煮沸溶解，两液合并，并 加入0.5%中性红水溶液6mL，待冷至50 55，倾注平板。 45、HE琼脂 1）成分 脙胨 12g 牛肉膏 3g 乳糖 12g 蔗糖 12g 水杨素 2g 胆盐 20g 氯化钠 5g 琼脂 1820g 蒸馏水 1000mL 0.4%溴麝香草酚蓝溶液 16mL Andrade指示剂 20mL 甲液 20mL 乙液 20mL pH7.5 甲液的配制 硫代硫酸钠 34g 柠檬酸铁铵 4g 蒸馏水 100mL 乙液的配制 去氧胆酸钠 10g 蒸馏水 100mL Andrade指示剂 酸性复红 0.5g 1mol/L氢氧化钠溶液 16mL 蒸馏水 100mL 将复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠 溶液。数小时后如复红褪色不全，再加氢氧 化钠溶液12mL。 2）制法 将前面七种成分溶解于400mL蒸馏水内作 为基础液；将琼脂加入于600mL蒸馏水内，加 热溶解。加入 甲液和乙液于基础液内，校正 pH。再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷至 5055，倾注平板。 注：此培养基不可高压灭菌。 46、SS琼脂 1）成分 基础培养基 牛肉膏 5g 脙胨 5g 三号胆盐 3.5g 琼脂 17g 蒸馏水 1000mL 完全培养基 基础培养基 100mL 乳糖 10g 柠檬酸钠 8.5g 硫代硫酸钠 8.5g 10%柠檬酸铁溶液 10mL 1%中性红溶液 2.5mL 0.1%煌绿溶液 0.33mL 注： 制好的培养基宜当日使用，或保存于冰 箱内于48h内使用。 煌绿溶液配好后应在10d以内使用。 可以购用SS琼脂的干燥培养基。 2）制法 加热溶化基础培养基，按比例加入上述染料 以外之各成分，充分混合均匀，校正至pH7.0， 加入中性红和煌绿溶液，倾注平板。 47、Ws琼脂 1）成分 脙胨 12g 牛肉膏 3g 氯化钠 5g 乳糖 12g 蔗糖 12g 十二烷基硫酸钠 2g 琼脂 15g Andrade指示剂 20mL 0.4%溴麝香草酚蓝溶液 16mL 甲液 20mL 蒸馏水 1000mL pH7.0 2）制法 除指示剂和甲液外，将其他成分加热溶 解，不需消毒，校正pH后加入指示剂和甲液 ，倾注平板应呈草绿色。 注： 供沙门氏菌分离用。 Andrade指示剂和甲液的配制均见HE 琼脂。 48、麦康凯琼脂 1）成分 蛋白胨