《植物组织培养》课件ppt第3章植物组织培养技术灭菌方法无菌操作技术

第三章 植物组织培养技术-灭 菌方法、无菌操作技术 内容： 灭菌 无菌操作 愈伤组织的分化与再分化、脱分化 形态发生 教学目的要求 1掌握外植体的选择条件与消毒方法； 2掌握外植体接种操作步骤及培养的环境 条件； 3了解愈伤组织形成的条件及愈伤组织形成 过程、形态发生的调控方法，掌握愈伤组织 的形态发生方式和植物组织培养中愈伤组织 培养的基础技术。 4一般掌握离体叶片和离体根培养基本过程 （选修）；掌握离体茎培养的种类和操作步 骤； 本节教学重点、难点： 重点：无菌操作技术；组培苗的培养 难点：无菌操作技术 第一节 外植体的选择和消毒 一、外植体的选择 选取性状优良的种质或特殊的基因型 1.选择健壮的植株 ： 健壮、无病虫 、发育正常 代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功 2.选择最适的时期 ：旺盛生长期 注意植物的生长季节和生长发育阶段：茎尖、花蕾、嫩叶 生长时间较长的块茎、鳞茎、球茎等，往往由于携菌量较多 ，不易消毒而难以培养成功。 3.选取适宜的大小 ：一般0.5-1cm; 脱毒0.2-0.3mm 材料太大易污染，也不需要；材料太小，易受 伤害胁迫、多 形成愈伤组织， 甚至难于成活 外植体（叶）的各个部分其芽、苗再生能力也很不相同 胶皮枫香树（Liquidamnbar styraciflua “Variegata”）叶 片外植体的供体及叶的部位对其不定芽形成的影响 外植体 部位 每个外植体形成不定芽分生组织的数目 由培养基上增 殖苗中的叶片 由温室生长2年的完 整植株上的叶片 叶 柄 叶 片 总 数 6.7 8.0 14.7 6.7 50.3 57.0 外植体培养于WPM附加0.1mg/L NAA和2.5mg/L BA的培养基中，实验用外 植体数为70 二、灭菌与消毒 （一）有菌和无菌的范畴 有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体 ，它的表面都是有菌的。 无菌的范畴： 经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其 他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体。 菌类： 细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。 茵的特点： 极小，肉眼看不见； 无处不有，适应能力强； 繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。 消毒： 指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不 再发生危害作用的过程。 （二）常用的灭菌与消毒方法 灭菌方法： 物理方法：如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常 压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波 、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等 灭菌措施； 化学方法：使用升汞、甲醛、过氧化氢、 高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、 抗菌素、酒精化学药品处理，以达灭菌效 果。 1.湿热灭菌（培养基） 高压灭菌的原理：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外 溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也 随之增加。在o1MPa的压力下，锅内温度达121。在此 蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 常用方法：关闭放气阀，通电后，待压力上升到O 05MPa时，关电源，打开放气阀，放出空气，待压力表指 针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到 01MPa开始计时，压力01-015MPa，20min。 注意：1、培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。 2、完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸 气，灭菌才能彻底。 2.灼烧灭菌（用于无菌操作的器械 ） 镊子、剪子、解剖刀等： 浸入95%的酒精中 酒精灯火焰上灼烧灭菌 冷却后，立即使用。 3.干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具） 利用烘箱加热到160-180C的温度（持续 90min）来杀死微生物。 注意： 1、干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为 包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的 塑料。 2、灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。 3、烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对 流和穿透； 4、到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱， 以免因骤冷而使器皿破裂。 缺点：干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。 4.过滤灭菌（不耐热的物质 ） 对象：不耐热又不能用高压灭菌处理的 制剂。如：一些生长调节剂，如赤霉素 、玉米素、脱落酸和某些维生素等。 滤膜网孔直径：0.45m以下，当溶液通 过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等 因大于滤膜直径而被阻。 5.紫外线和熏蒸灭菌（空间） (1)紫外线灭菌 紫外线的波长为200300nm，其中以260nm的杀菌 能力最强，要求距照射物以不超过1.2m为宜。 (2)熏蒸灭菌 使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气 和物体表面的微生物。方法简便，空间关闭紧密即可。 常用熏蒸剂：高锰酸钾、甲醛。 常用方法：房间关闭紧密，按58mlm3用量，将 甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸 时，房间可预先喷湿以加强效果。 6.喷雾灭菌（物体表面） 70%75%的酒精 l%-2%的来苏儿溶液 涂擦、喷雾 0.25%1%的新洁尔灭 （桌面、墙面、双手、植物材料表面等） 7.植物材料表面用消毒剂灭菌 第一步： 1、将采来的植物材料除去不用的部分，仔细洗 干净。 2、切割成适当大小（即灭菌容器能放人为宜 ）。 3、置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时 （可加入 洗衣粉）。 第二步：是对材料的表面浸润灭菌。 1.准备工作： 准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%75%酒精、 消毒液、无菌水、手表等。 2.酒精浸润消毒： 用70%酒精浸1030s。70%酒精穿透力强，也 很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。 3. 化学灭灭菌剂处剂处 理 消毒剂消毒原理： 利用氯气、重金属、原子态氧来杀菌。 灭灭菌剂剂 使用浓浓度 (%) 持续时续时 间间（min ） 去除的难难 易 效果 次氯氯酸 钙钙 910530易很好 次氯氯酸 钠钠 2530易很好 氯氯化汞0.1158较难较难最好 抗菌素450mg/ L 3060中较较好 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表 第三步.无菌水涮洗 是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。 灭菌后用无菌水涮洗34次即可； 升汞残毒较难去除，所以应当用无菌水涮洗610次。 第二节 外植体的接种和培养 一、无菌操作： 经过必要消毒的操作者在严格灭菌 的操作空间(接种室、超净台等)使用消 过毒的器皿所进行的操作。 （一）无菌操作步骤（实验课 ） (1)接种室消毒：在接种前用甲醛熏蒸接种室，在接种前20min， 打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯 (2)摆放接种用具：将培养基、接种用具等分别防入小推车或超净 工作台上(无菌水.镊子.解剖刀.酒精棉.酒精灯.培养皿.小烧杯等) (3)进入接种室：接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服， 并换穿拖鞋等； (4)手及台面消毒：用70%酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然 后按一定顺序擦拭工作台面； (5)培养材料灭菌：将接种材料预先放入烧杯，置入超净台进行表 面消毒。 (6)接种用具灭菌：先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子 浸泡在95%酒精并取出从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端 处，对培养皿要过火烤干； (7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。 注：接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳 嗽等；若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。 （二）接种技术 （实验课） 1. 消毒： 将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再 用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上。 2. 取材： 材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切 割。如叶片切成0.5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。在接种过程 中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。 3. 接种： 用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。接种后 ，将管口在火焰上再灼烧数秒钟，盖上瓶盖。 具体操作过程是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管囗靠近 酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。然后用镊 子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基。若是叶片直接附在 培养基上，以放13块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端 向上)外，其他尚无统一要求。 4. 标记： 注明接种日期、培养基编号等。 第二节 外植体的接种和培养 二、培养： 指把培养材料放在培养室(适宜光照、温 度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤 组织或再生植株的过程。 1培养方法 (1)固体培养法 用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。 优点：设备简单，操作易行。 缺点：养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中 毒现象发生。 (2)液体培养法 用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。 优点：能均衡提供养分。 缺点：透气性较差。 通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧 气的供给；速度：一般为50-100rmin。 滤纸桥方法 2培养步骤 (1)初代培养 即接种某种外植体后，最初的 几代培养。 目 的：获得无菌材料和无性繁殖系。 培养基：常用诱导或分化培养基，即培 养基中含有较多的细胞分裂素和少量的 生长素。 2培养步骤 (2)继代培养（扩繁培养）是继初 代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。 目的：繁殖出相当数量的无根苗，最后能 达到边繁殖边生根的目的。 扩繁的方法：切割茎段、分离芽丛 、分离胚状体、分离原球茎等。 2培养步骤 （3）生根培养 生根培养目的： 使生出的不定根浓密而粗壮。 生根培养基： 可采用12或者1/4MS培养基，降 低全部去掉细胞分裂素，并加入适量的 生长素(NAA、IBA等)。 3、培养过程中常出现的 问题及解决方法 （第四章 植物组织培养中常见问题及解决办法） A.培养外植体的污染 B.初代培养外植体的褐变 C.继代培养时材料的玻璃化初代 4.植物组织培养的环境条件 在植物组织培养中温度、光照、湿度 等各种环境条件，培养基组成、pH值、 渗透压等各种化学环境条件都会影响组 织培养育苗的生长和发育。 温度(temperature) 一般采用25 2。 低于15时培养，植物组织会表现生长停止，高 于35时对植物生长不利。 不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20 、月季足25-27、番茄是28。 温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影 响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽 的形成以28为最好，在12以下，33以上形成 率皆最低。 光照(light) 主要表现在光强、光质、以及光照时间方面 1光照强度(light intensity) 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的 研究情况看，光照强度对外植体及细胞的最初分裂有明显的影响 。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱 幼苗容易徒长。 2光质(light wave) 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显 的影响。如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织。 但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种 15d后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白 光下幼苗纤细。 3光周期(light period) 最常用的周期是16h光照/8h的黑暗。研究表明，一些植物的愈伤 组织在暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织。 湿度 (humidity) 实验室环境的相对湿度： 一般要求70%80%的相对湿度，常用加 湿器或经常洒水的方法来调节湿度。 湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成 分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进 行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。 培养容器内的相对湿度：100%相对湿度 渗透压(penetrating pressure) 12个大气压对植物生长有促进作用。 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此， 影响到渗透压的变化。 2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用 。 56个大气压植物生长就会完全停止。 6个大气压植物细胞就不能生存。 pH值 (pH value) 大多在5-6.5左右，一般培养基皆要求5.6-5.8 。不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的 。 pH值对琼脂的影响： 一般来说当pH值高于6.5时，培养基全变硬； 低于5时，琼脂不能很好地凝固。 pH值在培养基制作中的变化： 高温灭菌会降低pH值(约0.20.8个pH值) pH值大小调整可用01M的NaOH和0IM的HCI来 调整。lml的NaOH可使pH值升高02单位，lml的 HCl可使pH值降低02单位。调节时一定要充分搅 拌均匀。 种类类最适pH值值种类类最适pH值值 杜鹃鹃4.0月季5.8