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文档简介
第三章 植物组织培养技术-灭 菌方法、无菌操作技术 内容: 灭菌 无菌操作 愈伤组织的分化与再分化、脱分化 形态发生 教学目的要求 1掌握外植体的选择条件与消毒方法; 2掌握外植体接种操作步骤及培养的环境 条件; 3了解愈伤组织形成的条件及愈伤组织形成 过程、形态发生的调控方法,掌握愈伤组织 的形态发生方式和植物组织培养中愈伤组织 培养的基础技术。 4一般掌握离体叶片和离体根培养基本过程 (选修);掌握离体茎培养的种类和操作步 骤; 本节教学重点、难点: 重点:无菌操作技术;组培苗的培养 难点:无菌操作技术 第一节 外植体的选择和消毒 一、外植体的选择 选取性状优良的种质或特殊的基因型 1.选择健壮的植株 : 健壮、无病虫 、发育正常 代谢旺盛,再生能力强,培养后比较容易成功 2.选择最适的时期 :旺盛生长期 注意植物的生长季节和生长发育阶段:茎尖、花蕾、嫩叶 生长时间较长的块茎、鳞茎、球茎等,往往由于携菌量较多 ,不易消毒而难以培养成功。 3.选取适宜的大小 :一般0.5-1cm; 脱毒0.2-0.3mm 材料太大易污染,也不需要;材料太小,易受 伤害胁迫、多 形成愈伤组织, 甚至难于成活 外植体(叶)的各个部分其芽、苗再生能力也很不相同 胶皮枫香树(Liquidamnbar styraciflua “Variegata”)叶 片外植体的供体及叶的部位对其不定芽形成的影响 外植体 部位 每个外植体形成不定芽分生组织的数目 由培养基上增 殖苗中的叶片 由温室生长2年的完 整植株上的叶片 叶 柄 叶 片 总 数 6.7 8.0 14.7 6.7 50.3 57.0 外植体培养于WPM附加0.1mg/L NAA和2.5mg/L BA的培养基中,实验用外 植体数为70 二、灭菌与消毒 (一)有菌和无菌的范畴 有菌的范畴是:凡是暴露在空气中的物体 ,它的表面都是有菌的。 无菌的范畴: 经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体,经其 他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体。 菌类: 细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。 茵的特点: 极小,肉眼看不见; 无处不有,适应能力强; 繁殖力极强,条件适宜时便可大量滋生。 消毒: 指杀死、消除或充分抑制部分微生物,使之不 再发生危害作用的过程。 (二)常用的灭菌与消毒方法 灭菌方法: 物理方法:如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常 压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波 、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等 灭菌措施; 化学方法:使用升汞、甲醛、过氧化氢、 高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、 抗菌素、酒精化学药品处理,以达灭菌效 果。 1.湿热灭菌(培养基) 高压灭菌的原理:在密闭的蒸锅内,其中的蒸气不能外 溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内温度也 随之增加。在o1MPa的压力下,锅内温度达121。在此 蒸气温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 常用方法:关闭放气阀,通电后,待压力上升到O 05MPa时,关电源,打开放气阀,放出空气,待压力表指 针归零后,再关闭放气阀。关阀再通电后,压力表上升达到 01MPa开始计时,压力01-015MPa,20min。 注意:1、培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。 2、完全排除锅内空气,使锅内全部是水蒸 气,灭菌才能彻底。 2.灼烧灭菌(用于无菌操作的器械 ) 镊子、剪子、解剖刀等: 浸入95%的酒精中 酒精灯火焰上灼烧灭菌 冷却后,立即使用。 3.干热灭菌(玻璃器皿及耐热用具) 利用烘箱加热到160-180C的温度(持续 90min)来杀死微生物。 注意: 1、干热灭菌的物品要预先洗净并干燥,工具等要妥为 包扎,以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的 塑料。 2、灭菌时应渐进升温,达到预定温度后记录时间。 3、烘箱内放置的物品的数量不宜过多,以免妨碍热对 流和穿透; 4、到指定时间断电后,待充分冷凉,才能打开烘箱, 以免因骤冷而使器皿破裂。 缺点:干热灭菌能源消耗太大,浪费时间。 4.过滤灭菌(不耐热的物质 ) 对象:不耐热又不能用高压灭菌处理的 制剂。如:一些生长调节剂,如赤霉素 、玉米素、脱落酸和某些维生素等。 滤膜网孔直径:0.45m以下,当溶液通 过滤膜后,细菌的细胞和真菌的孢子等 因大于滤膜直径而被阻。 5.紫外线和熏蒸灭菌(空间) (1)紫外线灭菌 紫外线的波长为200300nm,其中以260nm的杀菌 能力最强,要求距照射物以不超过1.2m为宜。 (2)熏蒸灭菌 使化学药剂变为气体状态扩散到空气中,以杀死空气 和物体表面的微生物。方法简便,空间关闭紧密即可。 常用熏蒸剂:高锰酸钾、甲醛。 常用方法:房间关闭紧密,按58mlm3用量,将 甲醛置于广口容器中,加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸 时,房间可预先喷湿以加强效果。 6.喷雾灭菌(物体表面) 70%75%的酒精 l%-2%的来苏儿溶液 涂擦、喷雾 0.25%1%的新洁尔灭 (桌面、墙面、双手、植物材料表面等) 7.植物材料表面用消毒剂灭菌 第一步: 1、将采来的植物材料除去不用的部分,仔细洗 干净。 2、切割成适当大小(即灭菌容器能放人为宜 )。 3、置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时 (可加入 洗衣粉)。 第二步:是对材料的表面浸润灭菌。 1.准备工作: 准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%75%酒精、 消毒液、无菌水、手表等。 2.酒精浸润消毒: 用70%酒精浸1030s。70%酒精穿透力强,也 很易杀伤植物细胞,所以浸润时间不能过长。 3. 化学灭灭菌剂处剂处 理 消毒剂消毒原理: 利用氯气、重金属、原子态氧来杀菌。 灭灭菌剂剂 使用浓浓度 (%) 持续时续时 间间(min ) 去除的难难 易 效果 次氯氯酸 钙钙 910530易很好 次氯氯酸 钠钠 2530易很好 氯氯化汞0.1158较难较难最好 抗菌素450mg/ L 3060中较较好 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表 第三步.无菌水涮洗 是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。 灭菌后用无菌水涮洗34次即可; 升汞残毒较难去除,所以应当用无菌水涮洗610次。 第二节 外植体的接种和培养 一、无菌操作: 经过必要消毒的操作者在严格灭菌 的操作空间(接种室、超净台等)使用消 过毒的器皿所进行的操作。 (一)无菌操作步骤(实验课 ) (1)接种室消毒:在接种前用甲醛熏蒸接种室,在接种前20min, 打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯 (2)摆放接种用具:将培养基、接种用具等分别防入小推车或超净 工作台上(无菌水.镊子.解剖刀.酒精棉.酒精灯.培养皿.小烧杯等) (3)进入接种室:接种员先洗净双手,在缓冲间换好专用实验服, 并换穿拖鞋等; (4)手及台面消毒:用70%酒精棉球擦拭双手,特别是指甲处。然 后按一定顺序擦拭工作台面; (5)培养材料灭菌:将接种材料预先放入烧杯,置入超净台进行表 面消毒。 (6)接种用具灭菌:先用酒精棉球擦拭接种工具,再将镊子和剪子 浸泡在95%酒精并取出从头至尾过火一遍,然后反复过火尖端 处,对培养皿要过火烤干; (7)接种完毕后要清理干净工作台,可用紫外灯灭菌30min。 注:接种时,接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳 嗽等;若连续接种,每5天要大强度灭菌一次。 (二)接种技术 (实验课) 1. 消毒: 将初步洗涤及切割的材料放人烧杯,带入超净台上,用消毒剂灭菌,再 用无菌水冲洗,最后沥去水分,取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上。 2. 取材: 材料吸干后,一手拿镊子,一手拿剪子或解剖刀,对材料进行适当的切 割。如叶片切成0.5cm见方的小块;茎切成含有一个节的小段。在接种过程 中要经常灼烧接种器械,防止交叉污染。 3. 接种: 用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。接种后 ,将管口在火焰上再灼烧数秒钟,盖上瓶盖。 具体操作过程是:先解开包口纸,将试管几乎水平拿着,使试管囗靠近 酒精灯火焰,并将管口在火焰上方转动,使管口里外灼烧数秒钟。然后用镊 子夹取一块切好的外植体送入试管内,轻轻插入培养基。若是叶片直接附在 培养基上,以放13块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端 向上)外,其他尚无统一要求。 4. 标记: 注明接种日期、培养基编号等。 第二节 外植体的接种和培养 二、培养: 指把培养材料放在培养室(适宜光照、温 度条件)里,使之生长,分裂和分化形成愈伤 组织或再生植株的过程。 1培养方法 (1)固体培养法 用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。 优点:设备简单,操作易行。 缺点:养分分布不均,生长速度不均衡,并常有褐化中 毒现象发生。 (2)液体培养法 用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。 优点:能均衡提供养分。 缺点:透气性较差。 通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧 气的供给;速度:一般为50-100rmin。 滤纸桥方法 2培养步骤 (1)初代培养 即接种某种外植体后,最初的 几代培养。 目 的:获得无菌材料和无性繁殖系。 培养基:常用诱导或分化培养基,即培 养基中含有较多的细胞分裂素和少量的 生长素。 2培养步骤 (2)继代培养(扩繁培养)是继初 代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。 目的:繁殖出相当数量的无根苗,最后能 达到边繁殖边生根的目的。 扩繁的方法:切割茎段、分离芽丛 、分离胚状体、分离原球茎等。 2培养步骤 (3)生根培养 生根培养目的: 使生出的不定根浓密而粗壮。 生根培养基: 可采用12或者1/4MS培养基,降 低全部去掉细胞分裂素,并加入适量的 生长素(NAA、IBA等)。 3、培养过程中常出现的 问题及解决方法 (第四章 植物组织培养中常见问题及解决办法) A.培养外植体的污染 B.初代培养外植体的褐变 C.继代培养时材料的玻璃化初代 4.植物组织培养的环境条件 在植物组织培养中温度、光照、湿度 等各种环境条件,培养基组成、pH值、 渗透压等各种化学环境条件都会影响组 织培养育苗的生长和发育。 温度(temperature) 一般采用25 2。 低于15时培养,植物组织会表现生长停止,高 于35时对植物生长不利。 不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20 、月季足25-27、番茄是28。 温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度,也影 响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽 的形成以28为最好,在12以下,33以上形成 率皆最低。 光照(light) 主要表现在光强、光质、以及光照时间方面 1光照强度(light intensity) 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响,从目前的 研究情况看,光照强度对外植体及细胞的最初分裂有明显的影响 。一般来说,光照强度较强,幼苗生长的粗壮,而光照强度较弱 幼苗容易徒长。 2光质(light wave) 光质对愈伤组织诱导,培养组织的增殖以及器官的分化都有明显 的影响。如百合珠芽在红光下培养,8周后,分化出愈伤组织。 但在蓝光下培养,几周后才出现愈伤组织,而唐菖蒲子球块接种 15d后,在蓝光下培养首先出现芽,形成的幼苗生长旺盛,而白 光下幼苗纤细。 3光周期(light period) 最常用的周期是16h光照/8h的黑暗。研究表明,一些植物的愈伤 组织在暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织。 湿度 (humidity) 实验室环境的相对湿度: 一般要求70%80%的相对湿度,常用加 湿器或经常洒水的方法来调节湿度。 湿度过低会使培养基丧失大量水分,导致培养基各种成 分浓度的改变和渗透压的升高,进而影响组织培养的正常进 行。湿度过高时,易引起棉塞长霉,造成污染。 培养容器内的相对湿度:100%相对湿度 渗透压(penetrating pressure) 12个大气压对植物生长有促进作用。 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物,因此, 影响到渗透压的变化。 2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用 。 56个大气压植物生长就会完全停止。 6个大气压植物细胞就不能生存。 pH值 (pH value) 大多在5-6.5左右,一般培养基皆要求5.6-5.8 。不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的 。 pH值对琼脂的影响: 一般来说当pH值高于6.5时,培养基全变硬; 低于5时,琼脂不能很好地凝固。 pH值在培养基制作中的变化: 高温灭菌会降低pH值(约0.20.8个pH值) pH值大小调整可用01M的NaOH和0IM的HCI来 调整。lml的NaOH可使pH值升高02单位,lml的 HCl可使pH值降低02单位。调节时一定要充分搅 拌均匀。 种类类最适pH值值种类类最适pH值值 杜鹃鹃4.0月季5.8
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