生物制药学第三章基因工程制药

第三章 第三章 基因工程制药基因工程制药 第一节第一节 基因工程药物生产的基本过程基因工程药物生产的基本过程 DNADNA重组药物制造的主要步骤重组药物制造的主要步骤 获得目的基因 DNA的体外重组（切与连） 载体的选择 受体细胞的选择 重组DNA分子转化 （转） 转化子的筛选与鉴定（选） 外源基因的大规模表达和分离纯化 产品的检验和制剂制备 基因工程制药过程基因工程制药过程 l上游部分 l下游部分 上游主要程序上游主要程序 l目的基因的获得和克隆 l重组载体的构建 l重组载体转入宿主细胞 l外源基因在宿中细胞中的表达 l表达产物的检测 下游主要程序下游主要程序 l工程菌的发酵 l目的蛋白的分离纯化 l逐步加工成药品 第第二二节节 常用表达系统常用表达系统 一、大肠杆菌表达系统一、大肠杆菌表达系统 l载体要求 l有自主复制起点 l筛选标记 l启动子，能被RNA聚合酶识别 l终止子 l翻译起始信号 l多克隆位点 lpBV220系统 lpET系统 pBV220pBV220质粒质粒 菌株 DH10B JM109 DH5 pETpET质粒质粒 菌株 BL21 DE3 二、酵母表达系统二、酵母表达系统 l原核筛选标记 l真核转录和表达元件，包括启动子、终 止字、翻译起始信号 l真核复制起始位点或整合位点 l真核筛选标记 l载体要求 l原核复制起始位点 l 啤酒酵母表达系统 l毕赤酵母表达系统 l裂殖酵母表达系统 l汉逊酵母表达系统 lInvitrogen公司的pYES2质粒，含2复制序 列和pUC复制起点，Amp和Ura筛选标记， GAL1启动子和CYC2终止子 lpPIC9K全长9.3Kb，原核有氨苄和卡那抗 性，真核中是组氨酸和HG418筛选标记， 有和染色体重组的整合位点，在多克隆位 点的上游有信号肽序列，用甲醇诱导表达 pYES2pYES2 半乳糖激 酶启动子 pPIC9KpPIC9K 甲醇氧化酶 启动子 目前已发现 的、最强的 真核启动子 第三节第三节 基因工程制药上游技术基因工程制药上游技术 一、目的基因的获得一、目的基因的获得 l1. 化学合成法 l在核酸合成以上可以自动合成一条单链的 寡聚核苷酸，准确率比较高，但是费用也 高 l2. PCR法 l如果知道基因序列，且基因没有内含子， 就可以通过合成引物，通过PCR的方法人工 合成基因 l3. 逆转录法 l对有内含子的基因常采用的方法，具体工 程为：提取细胞或组织的总RNA，用逆转 录酶和OligodT合成cDNA的第一链，再通 过PCR方法合成第二连 二、目的基因的克隆二、目的基因的克隆 l一般是将目的基因连接到T载体上，但有时 候这一步可以省略 三、基因的体外重组三、基因的体外重组 l双酶切T载体和表达载体，体外连接 四、重组产物转入到宿主菌中四、重组产物转入到宿主菌中 l体外连接的产物，用合适的方法转入到宿 主菌中，如用氯化钙或电转化法转入到大 肠杆菌中，酵母的转化还要经历大肠杆菌 阶段 五、外源基因的表达五、外源基因的表达 l根据启动子的类型，采用不同的表达条件 ，如pET系统，用IPTG或乳糖诱导， pBV220系统采用温度诱导，毕赤酵母用甲 醇诱导 六、目的蛋白的检测六、目的蛋白的检测 l一般采用活性试验和/或电泳菌体总蛋白 质 第四节第四节 基因工程制药上游过程实例基因工程制药上游过程实例 实例一实例一 l引物，PCR扩增 lPCR产物连接到T载体上 l转化到大肠杆菌 lT载体双酶切 表达载体双酶切 l体外连接 l转化到大肠杆菌 l提取质粒 l转化到表达宿主菌 l诱导表达 l电泳检测蛋白 实例二实例二 l引物，PCR扩增 lPCR产物连接到T载体上 l转化大肠杆菌 lT载体双酶切 表达载体双酶切 l体外连接 l转化大肠杆菌 l提取质粒 l转化到酵母中 l活性检测 实例三实例三 l鲨鱼肝总RNA lOligodT 逆转录第一链 l鲨肝活性肽N端序列，OligodT lcDNA双链 l连接到T载体上 l双酶切T载体和表达载体 l体外连接两个片段 l转化到大肠杆菌中 l测序，与多肽序列对照 l诱导表达 l电泳检测分子量，活性试验 第五节第五节 基因工程菌的稳定性基因工程菌的稳定性 l工程菌的不稳定性大多数是由于 质粒不稳定造成的 l一、工程菌的稳定性 l质粒分裂的不稳定 :工程菌分裂时出现一 定比例不含质粒子代菌的现象 l质粒结构的不稳定 : 指外源基因从质粒 上丢失或者碱基重排、缺失而导致的工 程菌性能的改变 1. 1. 质粒不稳定产生的原因质粒不稳定产生的原因 l含质粒菌产生不含质粒菌的比率 l两种菌的比生长速度差异的大小 l插入的外源基因影响了质粒稳定区的结 构 2. 2. 提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法 l两阶段培养法 l发酵工艺条件的优化 l选择合适的宿主菌或质粒 l增大选择压力 l固定化技术 两阶段培养法两阶段培养法 l菌体生长的一定阶段的时候，进行诱导 表达 l大肠杆菌的pET系统 l毕赤酵母 发酵工艺条件的优化发酵工艺条件的优化 l通过适当发酵工艺，可以提高质粒的稳 定性，可以间隙改变发酵的环境参数， 如温度、溶氧量、酸碱度等 选择合适的宿主菌或质粒选择合适的宿主菌或质粒 l根据表达蛋白的性质，选择合适的宿主 菌和质粒搭配 lpET系统中的宿主菌有BL21、DE3、 DH10B等，质粒有pET3、5、12、14 、17、21、22、25、28、32、34、40 等 l相对而言，Kan抗性的质粒一般比Amp抗 性稳定 增大选择压力增大选择压力 lAmp的工作浓度一般在50g/ml，发酵培 养是可以加大到200g/ml 固定化技术固定化技术 l将细胞固定在载 体上进行培养 第六节第六节 重组蛋白高表达策略重组蛋白高表达策略 一、大肠杆菌表达系统一、大肠杆菌表达系统 l1. 外源基因的拷贝数 l2. 外源基因的表达效率 l3. 表达产物的稳定性 l4. 细胞的代谢负荷 l5. 发酵条件的优化 外源基因的拷贝数外源基因的拷贝数 l 一般情况下，菌体内质粒的拷贝数越 多，外源基因就越多，转录的RNA也就 越多，翻译出来的蛋白也就越多 外源基因的表达效率外源基因的表达效率 l就目前人们的认识水平，许多因素影响 外源基因的表达效率 l启动子 l核糖体结合位点 lSD序列起始密码子ATG的距离 l密码子的组成 表达产物的稳定性表达产物的稳定性 l外源基因在大肠杆菌中表达，表达产物 对宿主菌而言，是异物，所以大肠杆菌 体内常会产生一些蛋白，消化表达产物 ， l采用融合表达， 分泌表达， 点突变（改 变外源蛋白的酶切识别位点）， 选用蛋 白酶缺陷型的宿主菌 细胞的代谢负荷细胞的代谢负荷 l大量复制质粒和表达外源基因，会破坏 宿主菌原有的代谢平衡 l减轻细胞代谢负荷的一个方法是菌体的 生长和表达外源基因分为两个阶段 发酵条件的优化发酵条件的优化 二、酵母表达系统二、酵母表达系统 l1. 外源基因的拷贝数 l相对于大肠杆菌，酵母的质粒要少得多，而整合 型的质粒，如毕赤酵母，由于拷贝数可以比较高 ，所以现在用地非常普遍 l2. 外源基因的表达效率 l1）启动子 l2）分泌信号的效率 l3）终止序列的影响 l4）偏好密码子的使用 l3. 外源蛋白的糖基化 l4. 宿主菌的选择 l1）生长力强 l2）内源蛋白酶活性弱 l3）菌株性能稳定 l4）分泌能力强 5. 5. 发酵条件的优化发酵条件的优化 工程菌表达药物蛋白，表达量工程菌表达药物蛋白，表达量 越高越好？越高越好？ 高效表达的目的蛋白 无活性 无法有效复性 美国每年损失几十亿 第七节第七节 包含体包含体 l包含体（包涵体） ：又称光折射体，大 肠杆菌高量表达外源基因时，大量的表 达产物和DNA碎片、RNA、核糖体等结 合在一起形成的一种颗粒 l包含体中的蛋白质一般是不正确折叠的 蛋白，特别是二硫键的错配 酵母表达系统包含体？ ？ 一、减少包含体的策略一、减少包含体的策略 l 发酵温度 l分泌表达 l选用合适的宿主菌和载体 l稀有密码子 二、包含体的复性二、包含体的复性 l盐酸胍、去污剂（Triton）等处理 l蛋白变成完全随机的结构 l除去变性剂 l重新折叠成结构活性的蛋白 三、包含体复性方法三、包含体复性方法 l溶液中复性 l反胶束环境复性 l分子伴侣 l固相复性 第八节第八节 分离纯化实例分离纯化实例 基因工程表达一药物蛋白基因工程表达一药物蛋白 研究阶段和生产阶段研究阶段和生产阶段 分离纯化策略分离纯化策略 重组类人胶原蛋白重组类人胶原蛋白 l l 胶原是结缔组织的结构蛋白胶原是结缔组织的结构蛋白 l l 胶原蛋白是在提取胶原时，结构没胶原蛋白是在提取胶原时，结构没 有改变的一类蛋白有改变的一类蛋白 羟脯氨酸 l l 重组类人胶原蛋白是通过逆转录在重组类人胶原蛋白是通过逆转录在 人体中钓取基因后，进行了某些位人体中钓取基因后，进行了某些位 点的突变，并在大肠杆菌中表达的点的突变，并在大肠杆菌中表达的 重组蛋白重组蛋白 l l 分子量分子量7070，000000 l l 方法：亲和层析纯化方法：亲和层析纯化 l发酵后的工程菌，5000r/min离心30分钟 l质液比1：6将菌体悬浮于细胞破碎缓冲 液中（1mmol/LEDTA,5mmol/LTris） l冰水浴中超声波破碎仪间断超声十次， 每次90秒 破碎液于4，5000r/min离心1小时，收集 上清液 l上清液用硫酸铵分级沉淀 l收集15%65%饱和度的蛋白质沉淀 l沉淀溶解在缓冲溶液中（20 mmol/ LTris- HCl，pH8.0） l截流分子量30，000的超滤膜脱盐浓缩 l脱盐的样品和平衡缓冲液（ 1mmol/LNaCl）1：1混合 l层析柱用锌离子充分螯合，并用10 倍体积的平衡缓冲液平衡 l上样后，平衡液冲洗，挂柱 l100 mmol/ L的NH4Cl洗脱 76 包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取） 第十节第十节 基因工程药物介绍基因工程药物介绍 一、重组胰岛素一、重组胰岛素 l胰岛素的作用是降低血糖浓度，达到治 疗糖尿病的目的 l猪胰岛素,不良反应 l1982年开始，美国等批准用DNA重组技 术生产的人源化胰岛素 l三种生物合成胰岛素的方法 l(a) AB链分别表达法 体外折叠成功率 低，通常只有1020 l(b) 人胰岛素原表达法 由于C肽的存在 ，胰岛素原在复性条件下能形成天然的 空间构象，为三对二硫键的正确配对提 供了良好的条件，使得体外折叠率高达 80以上 目前Ely Lily用这种工艺路线 年产几十吨的重组人胰岛素，其经济效 益相当可观。 l(c) AB链同时表达法 1957年Isaccs等发现病毒干扰现象，即病毒感 染的细胞能产生一种因子，作用于其他细胞干 扰病毒复制，因而命名为干扰素。 根据产生干扰素细胞的来源、理化性质和生物 活性等差异，可分为、等3种，其中 IFN-为多基因产物，有23种以上的亚型。 二、重组干扰素二、重组干扰素 l上个世纪50年代末期临床