分子生物技术ppt课件

分子生物技术 在生理学中的应用 杜军 生理学系 细胞复苏和传代的基本过程 1、从液氮中取出冻存管，迅速移入37温水中，轻轻摇 动，令其内容物尽快融化。 2、取出冻存管置于超净台中，用酒精消毒后旋开盖子， 用吸管吸出细胞悬液，放入离心管并加入10倍以上的完 全培养基，1100rpm离心5 min，去上清。 3、加入完全培养基约4 mL，吹匀后接种于细胞培养瓶 中。置于37、5% CO2的培养箱中静置培养，次日更换 一次培养基。 4、待细胞长至致密单层时移去培养基，用PBS清洗细胞2 次，加入37预热的0.25% 胰蛋白酶2mL消化3min左 右。显微镜下观察到细胞逐渐变圆但尚未离壁时，吸走 胰酶。 5、加入约2mL DMEM完全培养基吹打使细胞悬浮，室温下 1100rpm离心5min，弃上清。细胞沉淀中加入DMEM完全 培养基，按5105个细胞/mL的密度接种于培养瓶中， 置于37、5% CO2细胞培养箱中培养。 细胞划痕实验的基本过程 （1）制备培养单层细胞：将细胞密度为1105的细胞接种于96 孔培养 板中，每组设多个平行样本，常规培养至形成细胞单层； （2）人工划痕：在单层培养细胞上，用移液器吸头沿培养板底部作“一 ”字形划痕，倒置显微镜下拍摄并确定划痕边缘区域。将培养液更换 为无血清培养液，按分组要求继续培养； （3）迁移能力测定：细胞处理结束后，倒置显微镜下拍照并确定划痕边 缘，计算处理前后划痕边缘相对距离的差值。 transwell实验的基本过程 （1）胰酶消化对数生长期细胞，制备细胞悬液。 （2）按每孔100L（细胞数为5104）加入24 孔板中8.0m孔径博伊 登小室上层，小室下层加入600L的DMEM培养基，37条件下孵育1h 。 （3）随后向小室下层培养基中加入刺激物（如血清、EGF），继续培养 24h。 （4）将小室从24孔板中取出，用4%多聚甲醛固定细胞20min后，用棉签 轻轻擦去膜上表明未迁移通过膜的细胞。 （5）随后用0.1%结晶紫染色5min，清水漂洗3次后，倒置显微镜下观察 ，计所有穿过膜的细胞数。 采用TRIzol试剂（Invitrogen）提取细胞总RNA， 取1.0g RNA样品，采用SuperScript First-Strand Synthesis kit (Invitrogen) 试剂盒合成cDNA。采用 SYBR Green PCR master mix试剂和ABI 7500 Fast Real-Time PCR System仪器进行定量PCR检测。采用 Ct值的方法对各个样品中基因表达水平进行相对定 量。引物由上海捷瑞公司合成。 qPCR实验的基本过程 （1）提取总RNA 细胞分组处理后，每孔加入1ml Trizol，混匀，使细胞充分裂解后，移入1.5ml 无RNase离 心管中，室温静置3-5min； 加200l氯仿，充分混匀，室温静置2 min； 将离心管于4，12000g，离心20min； 用移液器小心吸出上层液相，放入另一离心管中； 加入与所移出上层液相相同体积的异丙醇，以促进RNA沉淀，轻轻混匀，室温静置10min； 4，12000g，离心10min，弃上清； 在沉淀中加入1ml 75 %乙醇（DEPC水现配），轻轻洗涤沉淀； 4，12000g，离心5min，弃上清； 重复步骤； 稍微晾干沉淀，约10min，在RNA略显透明时，加入50100l DEPC水溶解RNA，4静置过夜 使沉淀充分溶解，-70保存。 PCR实验的基本过程 （2）定量和检测总RNA 紫外分光光度计检测RNA的产量，用98l DEPC水调零后 ，加2l RNA样品，在260nm处的吸光度，1OD=40g/ml； 根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯 RNA的OD260/OD280比值应接近2.0（比值最好在1.9-2.1之 间）。 （3）RT-PCR 取1g总RNA进行反转录，37，1h，合成cDNA； 引物分别为：VEGF 5-ACCAAGGCCAGCACATAGG-3 (sense) 和 5- ACGCTCCAGGACTTATACCG-3 (antisense)；内参为18S rRNA 5- ACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3 (sense) 和 5-CTGACCGGGTTGGTTTTGAT- 3 (antisense)； 根据样品数目依说明书混合PCR反应体系，分至每个PCR小管，每管 加入1l cDNA产物，PCR条件按说明书，共40次循环； PCR产物的鉴定 A. 0.6g琼脂糖加入1TAE 50ml，微波炉加热至琼脂糖溶解，稍微冷 却后加入GoldView染料2.5l，混匀，铺板凝固后使用； B. 电泳槽中注入1TAE溶液至高于凝胶面，PCR产物加相应体积的6 加样缓冲液，混匀上样，用DNA 标准品作为参照，110V电泳20min； C. 紫外灯下观察电泳结果并拍照保存。 全蛋白提取 细胞分组处理后，用预冷的PBS清洗细胞2次后吸干残留的PBS； 加预冷全蛋白提取缓冲液0.5ml，冰上振荡裂解细胞15min； 细胞刮刀刮取细胞，上下吹打细胞数次，使其悬浮，吸取细胞裂解悬液转 移至预冷的1.5ml EP管中，冰上振荡15min； 4离心（12,000rpm，20min）； 将上清转入预冷的1.5ml EP管，-70保存备用； BCA法测定蛋白浓度。 免疫印迹实验的基本过程 免疫印迹 将蛋白样品与加样缓冲液混合，100加热5 min，离心3 min，取上清加 样后进行蛋白电泳； 电泳条件为初始电压80 V（30 min），待样品进入分离胶后，电压增至 110 V，直至电泳结束； 电泳结束后，用硝酸纤维素膜进行转膜。转膜电流1.2 mA/cm2胶面积， 250mA恒流湿转2h； 转膜完成后，用立春红染液染色观察转膜效果，TBST洗去立春红（此步染 色可省略）； 纤维膜与5 %封闭液室温孵育1h； TBST缓冲液洗膜5 min3次； 加一抗，杂交袋内平缓摇动，4过夜； 回收一抗，TBST缓冲液洗膜5 min3次； 加相应二抗，杂交袋内平缓摇动，室温1 h； 弃液体，TBST缓冲液洗膜5 min2次，TBS缓冲液洗膜1次； 加发光底物ECL，凝胶成像及分析系统拍照并进行图像灰度扫描，分析比 较目标条带的净光密度值。 褪黑素对SGC-7901人胃癌细胞粘附和 迁移的影响 目的：研究褪黑素对SGC-7901人胃癌细胞粘附和迁移能力的影响及探索可能 的分子机制。 方法：用不同浓度的褪黑素孵育人SGC-7901人胃癌细胞24h，通过免疫印迹方 法检测F-actin和G-actin蛋白表达水平，通过免疫荧光法检测细胞骨架结构 的改变，通过细胞粘附实验观察胃癌细胞对血管内皮细胞粘附能力的变化， 通过划痕实验检测褪黑素对细胞迁移能力的影响。 结果：褪黑素使SGC-7901人胃癌细胞F-actin量明显降低，同时细胞骨架结构 发生重组，应力纤维出现断裂；褪黑素可抑制胃癌细胞对血管内皮细胞的粘 附及迁移能力。 结论：褪黑素可能通过破坏细胞内应力纤维结构的稳定，最终导致了胃癌细 胞的粘附和迁移能力的降低。 图1 褪黑素对SGC-7901细胞骨架和胞浆组分中actin分布的影响。 正常组和1mM褪黑素处理组比较， *P0.05, n=3。 Fig 1 The redistribution of actin during melatonin treatment in SGC-7901 cells 图2 褪黑素诱导SGC-7901人胃癌细胞细胞骨架发生重构(荧光显微镜，400) Fig 2 Melatonin induced rearrangement of cytoskeleton in SGC-7901 human gastric cancer cells (Fluorescence microscopy，400) 两组间比较：正常组和1mM褪黑素处理组比较， *P0.05, n=6。 图3 褪黑素抑制SGC-7901人胃癌细胞的迁移能力 Fig 3 Melatonin suppressed migration of SGC-7901 human gastric cancer cells A. 倒置显微镜图片(200)； B. 荧光显微镜图片：1.