微生物的利用酶的应用复习ppt课件

微生物的利用、酶的应用 -2- 考点一大肠杆菌的培养和分离 液体 灭灭菌 培养 -3- 涂布 倒置 -4- 1.大肠杆菌 革兰兰氏阴性、兼性厌厌氧的肠肠道杆菌,在肠肠道中一般对对人无害,属原核 生物,是基因工程中被广泛采用的工具。 2.培养基 (1)分类类:按照物理性质质可分为为液体培养基、半固体培养基和固体培 养基。在液体培养基中加入凝固剂琼剂琼 脂后,制成琼琼脂固体培养基。微 生物在固体培养基表面生长长,可以形成肉眼可见见的菌落。 (2)成分:一般都含有水、碳源、氮源、无机盐盐和生长长因子五类营类营 养 物质质。还还需满满足不同微生物生长对长对 pH、特殊营营养物质质及氧气的要求 。 (3)制作牛肉膏蛋白胨胨固体培养基。 制作牛肉膏蛋白胨胨固体培养基的方法步骤骤:计计算称量溶化、调调 pH灭灭菌倒平板。 -5- 3.无菌技术 (1)获获得纯净纯净 培养物的关键键是防止外来杂杂菌的入侵。应应根据实实 际际情况进进行消毒和灭灭菌。 (2)消毒与灭灭菌的区别别 消毒是指使用较为较为 温和的物理或化学方法仅杀仅杀 死物体表面或 内部一部分对对人体有害的微生物(不包括芽孢孢和孢孢子)。消毒方法 有煮沸消毒法,还还有化学药剂药剂 (如酒精、氯氯气、石炭酸等)消毒、紫 外线线消毒等。 灭灭菌则则是指使用强烈的理化因素杀杀死物体内外所有的微生物, 包括芽孢孢和孢孢子。灭灭菌方法有灼烧灭烧灭 菌、干热灭热灭 菌、高压压蒸汽 灭灭菌等。 -6- (3)无菌操作要求 各种器皿必须须是无菌的。 各种培养基必须须是无菌的。 菌转转移操作的过过程必须须是无菌的。 (4)灭灭菌方法 高压压蒸汽灭灭菌法:即用高压压蒸汽灭灭菌锅锅在121 (1 kg/cm2 压压力)下灭灭菌15 min。 干热灭热灭 菌法:用干热灭热灭 菌箱对对耐热热器具在160 维维持 2 h 或 170 维维持1 h灭灭菌。 酒精灯灼烧烧法:如接种环环在酒精灯火焰上灼烧灭烧灭 菌。酒精 灯火焰上方无菌区,可使菌转转移过过程在无菌条件下完成。 紫外灯照射灭灭菌:用紫外灯照射灭灭菌30 min。 -7- (5)消毒方法。 煮沸消毒法:100 煮沸56 min可以杀杀死微生物的营营养细细 胞和一部分芽孢孢,可用于培养器皿的消毒。 巴氏消毒法:80 中15 min或7075 中30 min,实际实际 生产产 中常用于鲜鲜奶的消毒。 乙醇消毒法:70%乙醇杀杀菌能力最强,常用于实验时实验时 操作者 手臂的消毒。 (6)含抗生素的牛奶不能发发酵为为酸奶的原因:牛奶发发酵成酸奶 是利用乳酸菌发发酵来完成的。乳酸菌属于细细菌,抗生素有抑制甚 至杀杀死细细菌的作用。 -8- 4.细菌的培养与分离 (1)细细菌培养 用LB液体培养基扩扩大培养大肠肠杆菌,细细菌以分裂的方式 繁殖,分裂速度很快,条件适宜时时,约约20 min可分裂一次。 如要将已有细细菌培养物转转移到新的培养基,一般用接种 环转环转 移带带菌的培养物。 -9- (2)细细菌分离 划线线分离法:用接种环环在琼琼脂固体培养基表面连续连续 划线线操 作,将聚集的菌种逐步分散到培养基表面。培养1020 h后,可以 得到由一个细细菌繁殖而来的肉眼可见见的细细胞群,即菌落。 稀释释涂布分离法:将菌液先进进行一系列的梯度稀释释,然后将 不同稀释释度的菌液分别别涂布到琼琼脂固体培养基的表面,然后进进 行培养。 两种方法比较较:划线线分离,方法简单简单 ;涂布分离,单单菌落更易 分开,但操作复杂杂些。两种方法都能将混杂杂在一起的微生物分 离成单单个细细胞,并能在培养基表面形成单单个菌落,以便分离和纯纯 化菌种。 -10- 5.大肠杆菌的培养和分离实验 (1)实验实验 目的 进进行大肠肠杆菌的扩扩增,利用LB液体培养基进进行细细菌培养的操 作。 进进行大肠肠杆菌的分离,用LB固体培养基进进行细细菌的划线线培养 。 说说明大肠肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。 (2)实验实验 步骤骤 灭灭菌:用高压压蒸汽灭灭菌锅锅在121 (1 kg/cm2压压力)下对对LB液体 培养基、LB固体培养基和培养皿灭灭菌15 min。 倒平板:待冷却至60 左右时时,将三角瓶中的培养基在超净净台 上分装至几个培养皿中,制成固体培养基。 扩扩大培养:将大肠肠杆菌用接种环环在无菌操作条件下接种至三角 瓶中的液体培养基中,37 摇摇床振荡荡培养12 h,完成大肠肠杆菌培养 。 -11- 划线线分离:从前一步培养得到的菌液中获获取菌种,用接种环环 以划线线法接种至第二步制得的固体平面培养基中,在37 恒温 箱中培养1224 h后观观察菌落。 菌种保存:在无菌条件下将单单菌落用接种环环取出,再用划线线 法接种在斜面上,37 培养24 h后,置于4 冰箱内保存。 实验结实验结 束后,为为防止细细菌污污染,需要对对培养物进进行灭灭菌处处理 。 (3)实验结实验结 果及相应结论应结论 若观观察到划线线的末端出现现不连续连续 的单单个菌落,表明菌已被分 离。 -12- 例题为了调查某河流的水质状况,某研究小组测定了该河流水 样中的细菌含量,并进行了细菌分离等工作。回答下列问题。 (1)该该小组组采用稀释释涂布平板法检测检测 水样样中的细细菌含量。在涂 布接种前,随机取若干灭灭菌后的空白平板先行培养了一段时间时间 ,这这 样样做的目的是 ;然后,将1 mL 水样样稀释释100倍,在3个平板上用涂布法分别别接入0.1 mL稀释释液; 经经适当培养后,3个平板上的菌落数分别为别为 39、38和37。据此可 得出每升水样样中的活菌数为为 。 (2)该该小组组采用平板划线线法分离水样样中的细细菌。操作时时,接种环环 通过过 灭灭菌,在第二次及以后的划线时线时 ,总总是从上一次 划线线的末端开始划线线。这样这样 做的目的是 。 检测培养基平板灭菌是否合格 3.8107 灼烧烧 将聚集的菌体逐步稀释释以便获获得单单个菌落 -13- (3)示意图图A和B中, 表示的是用稀释释涂布平板法接种培养后 得到的结结果。 (4)该该小组组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀,一部分进进 行静置培养,另一部分进进行振荡荡培养。结结果发现发现 :振荡荡培养的细细 菌比静置培养的细细菌生长长速度快。分析其原因是:振荡荡培养能提 高培养液中 的含量,同时时可使菌体与培养液充分接 触,提高 的利用率。 B 溶解氧 营营养物质质 -14- 下面是肺炎双球菌离体转化实验的主要步骤: (1)实验实验 用的器具必须须是无菌的,常用 法 灭灭菌。用此法对对培养基灭灭菌时时,常将培养基装在 (器 皿)中进进行。 (2)实验实验 操作需在超净净工作台上进进行。工作台上,实验实验 前一 段时间时间 需打开,实验实验 中需关闭闭的是 。 A.酒精灯 B.照明灯 C.过滤风过滤风D.紫外灯 高压蒸汽灭菌 三角瓶 D -15- (3)平面培养基与悬悬浮培养所用的培养基相比,应应增加 成分。 (4)常用涂布法给给平面培养基接种。下列叙述错误错误 的是 。 A.接种的目的是使细细菌相互分离 B.接种需过滤过滤 除去杂杂菌后进进行 C.接种工具需灼烧烧后使用 D.接种需在酒精灯火焰旁进进行 (5)在37 恒温箱中培养时时,培养皿需 ,主要目的是避免 水滴影响 的形成。 (6)培养后,如果观观察到菌落重叠,则则在涂布法接种之前需进进行 操作。 凝固剂剂(琼琼脂) B 倒置 单单菌落 稀释释菌液 -16- 考点二分离以尿素为氮源的微生物 细细菌悬悬液 菌落 -17- 1.土样样的获获得:在有哺乳动动物排泄物的地方取得。 2.实验实验 步骤骤 -18- 3.微生物两种常用分离方法比较较 -19- 例题从土壤中分离以尿素为氮源的细菌,实验过程如图所示: (1)图图中物质质A为为 ,若要统计统计 每克土壤样样品中以尿 素为为氮源的细细菌的活菌数目,宜采用 法接种到尿素 培养基上,对对照组组配制的培养基为为 培养基,若用同 浓浓度的土壤稀释释液接种,实验组实验组 培养皿中菌 (填“大于 ”“等于”或“小于”)对对照组组。在能利用尿素的细细菌菌落周围围,有 红红色环带环带 出现现的原因是 。 (2)下列对对尿素溶液进进行灭灭菌的最适方法是 灭灭菌。 A.高压压蒸汽 B.紫外灯照射 C.70%酒精浸泡 D.过滤过滤 无菌水 涂布分离 LB全营养 小于 能利用尿素的细菌产生的脲酶将培养基中的尿素分解, 产生的氨使指示剂呈红色 D -20- (3)下列培养基中,能分离出分解尿素的细细菌的是 。 A.葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红红、琼琼脂糖、水 B.葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红红、琼琼脂糖、水、尿 素 C.NaCl、琼琼脂糖、水、蛋白胨胨、酵母提取物、尿素 D.葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红红、琼琼脂糖、水、蛋 白胨胨、酵母提取物 (4)欲将分离得到的以尿素为为氮源的细细菌进进行扩扩大培养 ,应应使用LB 培养基。 B 液体 -21- 幽门螺杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病 因素。在患者体内采集样本并制成菌液后,进行分离培养。实验 基本步骤如下: 请请回答下列问题问题 。 (1)在配制培养基时时,要加入尿素和酚红红指示剂剂,这这是因为为Hp含 有 ,它能以尿素作为为氮源;若有Hp,则则菌落周围围会出现现 色环带环带 。 (2)步骤骤X表示 。在无菌条件下操作时时,先将菌液稀释释 ,然后将菌液 到培养基平面上。菌液稀释释的目的是获获得 菌落。 脲酶 红 接种 涂布 单 -22- (3)在培养时时,需将培养皿倒置并放在 中。若 不倒置培养,将导导致 。 (4)临临床上用 14C呼气试验检测试验检测 人体是否感染Hp,其基本原理 是Hp能将 14C标记标记 的 分解为为NH3和 14CO2。 恒温培养箱 无法形成单菌落 尿素 -23- 考点三果汁中的果胶和果胶酶 半乳糖醛醛酸甲酯酯 甲酯酯 黑曲 澄清 -24- 1.果胶 (1)化学组组成:半乳糖醛醛酸和半乳糖醛醛酸甲酯酯。 (2)作用:是植物细细胞壁的主要成分之一。将植物细细胞粘合在 一起。去除果胶,会使植物组织变组织变 得松散。如山楂果实实中果胶 含量最多,煮沸后的山楂泥可制成山楂糕。 (3)特性:不溶于乙醇,这这是鉴别鉴别 果胶的简简易方法。 2.果胶酶 (1)化学成分:蛋白质质。 (2)作用:果胶酶和果胶甲酯酯酶可把果胶分解成可溶性的半乳糖 醛醛酸,使浑浊浑浊 的果汁变变得澄清。 (3)来源:常用黑曲霉、苹果青霉等来生产产果胶酶。 -25- 3.酶活性 酶活性大小可用在一定条件下,酶所催化的某一化学反应应速率 来表示。反应应速率可用单单位时间时间 内反应应物的减少量或产产物的生 成量来表示。影响酶活性的因素有温度、酸碱度及酶抑制剂剂等 。 4.果汁中果胶和果胶酶实验 (1)实验实验 目的 探究制作果汁的最佳条件。 检测检测 果胶酶活性。 (2)实验实验 步骤骤、结结果、结论结论 利用果胶酶制作果汁的实验实验 步骤骤。 第一步,制备备水果匀浆浆:用小刀除去苹果或山楂果实实中带带种子的 部分,切成块块后,放入匀浆浆机中,再加入少量水制成匀浆浆。 -26- 第二步,设设置对对照组组:取A、B两烧烧杯,各加入5 g匀浆浆液,A加入10 mL黑曲霉的提取液或果胶酶溶液,B加入10 mL 水,间间歇搅搅拌2030 min。 实验结实验结 果:A组组澄清度高,B组组澄清度低。 实验结论实验结论 :果胶酶能水解果胶,使浑浊浑浊 的果汁变变澄清。 探究利用果胶酶制作果汁的最佳条件的实验实验 步骤骤(紧紧接上面第 二步)。 第三步,取4支试试管,编编号14号。将A烧烧杯中混合物分别别放入1号和 2号试试管中,将B烧烧杯中混合物分别别放入3号和4号试试管中,每支均放入 4 mL。 第四步,将1号和3号试试管放在沸水浴或酒精灯上加热热,2号和4号试试 管不加热热,观观察。 第五步,再向上述4支试试管中各加入95%的乙醇4 mL,观观察。 果汁中的果胶和果胶酶 试管号1234 苹果匀浆 液（ml） 3333 果胶酶液 （ml） 0.50.500 H2O000.50.5 1005min1005min 95%乙醇 （ml） 2222 现象 1和4没法比较，是不同的变量 最澄清最浑浊？ 加热的目的？ 我们看到的浑浊不是果胶而是果渣，果胶是透 明的。由于果胶的存在溶液粘度较高，果渣不容易 析出，因此果汁会浑浊。 加果胶酶是降解果胶，加酒精是析出果胶，果 胶少了溶液粘度下降，果渣析出，果汁澄清。 加热直接使溶液的粘度降低，使果汁澄清。 -29- 果胶是植物细胞细胞壁及胞间层的主要组成成分之一。果胶酶 能够水解果胶,瓦解植物细胞的细胞壁及胞间层。在果汁生产中 应用果胶酶可以提高出汁率和澄清度。请你帮助完成以下有关 果胶酶和果汁生产的实验课题。 实验实验 用具和材料:磨浆浆机、烧烧杯、试试管、量筒、刀片、玻璃棒 、漏斗、纱纱布等;苹果、质质量分数为为2%的果胶酶溶液、蒸馏馏水 等。 .验证验证 果胶酶在果汁生产产中的作用 实验实验 方法及步骤骤: (1)将苹果洗净净去皮,用磨浆浆机制成苹果泥,加入适量蒸馏馏水备备用 。 (2)取两个100 mL洁净洁净 的烧烧杯,编编号为为1、2号,按相应应程序进进行 操作,请请把表中未填写的内容填上。 -30- (3)取出两个烧烧杯,同时进时进 行过滤过滤 。一定时间时间 后,观观察(或比较较) 和 ,并记录结记录结 果。 (4)最可能得到的实验结实验结 果及结论结论 : 。 注入果胶酶溶液 滤滤出的果汁体积积果汁澄清度 相同时间时间 内,1号烧烧杯中滤滤出果汁体积积比2号烧烧杯多,且澄清度高, 说说明果胶酶对对果胶的水解有催化作用 -31- .探究果胶酶催化果胶水解的最适pH 本课题实验课题实验 步骤骤中,在进进行果胶酶溶液和苹果泥的 混合并调调整pH时时有下面两种操作: 方法一:将试试管中的果胶酶溶液和烧烧杯中的苹果泥相 混合,再把混合液的pH分别调别调 至4、5、6、7、8、9、 10。 方法二:将试试管中的果胶酶溶液和烧烧杯中的苹果泥的 pH分别调别调 至4、5、6、7、8、9、10,再把pH相等的果 胶酶溶液和苹果泥相混合。 -32- (1)请问请问 上述哪一种操作更科学: 。并说说明 理由: 。 (2)如果用曲线图线图 的方式记录实验结记录实验结 果,在现现有的条件下,当 横坐标标表示pH,纵纵坐标标表示 ,实验实验 的操作 和记录记录 是比较较切实实可行的。根据你对对酶特性的了解,在图图中选选 择择一个最可能是实验结实验结 果的曲线图线图 : 。 方法二 方法二的操作能确保酶的反应环应环 境从一开始便达到 实验实验 的预设预设 pH 果汁体积积 甲 -33- 工业生产果汁时,常常利用果胶酶破除果肉细胞壁以提高出汁 率。为研究温度对果胶酶活性的影响,某学生设计了如下实验: 将果胶酶与苹果泥分装于不同试试管,在10 水浴中恒温处处理 10 min(如图图A)。 将步骤骤处处理后的果胶酶和苹果泥混合,再次在10 水浴中 恒温处处理10 min(如图图B)。 将步骤骤处处理后的混合物过滤过滤 ,收集滤滤液,测测量果汁量(如图图 C)。 -34- 在不同温度条件下重复以上实验实验 步骤骤,并记录记录 果汁量,结结果 如下表: 根据上述实验实验 ,请请分析并回答下列问题问题 。 (1)果胶酶能破除细细胞壁,是因为为果胶酶可以促进细进细 胞壁中果胶 的水解,产产物是 。 (2)实验结实验结 果表明,当温度为为 左右时时,果汁量最多,此 时时果胶酶的活性 。 (3)为为什么该实验该实验 能够够通过测过测 定滤滤出的苹果汁的体积积大小来 判断果胶酶活性的高低? 。 半乳糖醛酸 40 最高 果胶酶将果胶分解,破坏了植物细胞的细胞壁和胞间层,使榨 取果汁更容易,而且大量的果胶被分解也会增加果汁的量。 因此苹果汁的体积大小反映了果胶酶催化分解果胶的能力 -35- (4)果胶酶作用于一定量的某种物质质(底物),保持温度、pH在 最适值值,生成物量与反应时间应时间 的关系如下图图: 在35 min后曲线变线变 成水平是因为为 。 若增加果胶酶浓浓度,其他条件不变变,请请在原图图上画出生成物量 变变化的示意曲线线。 底物消耗完毕 -36- -37- 考点四-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测 吸 附 法 KI-I2 -38- 1.固定化酶 (1)概念:将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质质上 ,使之成为为不溶于水而又有酶活性的制剂剂。 (2)将酶改造为为固定化酶的原因。 由于酶在水溶液中很不稳稳定,且不利于工业业化使用,所以要将 酶改造成固定化酶。 (3)酶固定化的方法 吸附法、共价偶联联法、交联联法和包埋法等。 (4)固定化酶作用的机理 将酶吸附在惰性载载体(如石英砂)上,制成固定化酶,并装柱,当底 物经过经过 固定化酶柱时时,在酶的作用下转变转变 成产产物。 -39- 2.实验原理 淀粉(遇碘显蓝显蓝 色) 糊精(遇碘显红显红 色) 麦芽糖(遇碘不显显色) 葡萄糖 3.-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用检测的实验 (1)实验实验 目的 制备备固定化-淀粉酶。 进进行淀粉水解的测测定。 -40- (2)实验实验 材料的制备备 -淀粉酶的固定化。 在烧烧杯中将5 mg -淀粉酶溶于4 mL蒸馏馏水中(由于酶不纯纯,可 能有些不溶物)。 再加入5 g石英砂,不时搅时搅 拌,30 min后装入1支下端接有气门门芯 并用夹夹子封住的注射器中(石英砂体积约积约 4 mL)。 用10倍体积积蒸馏馏水洗涤涤此注射器,以除去未吸附的游离淀粉酶, 流速为为1 mL/min。 可溶性淀粉溶液:取50 mg可溶性淀粉溶于100 mL热热水中,搅搅 拌均匀。 5 mmol/L KI-I2溶液:称取0.127 g碘和0.83 g碘化钾钾,加蒸馏馏水 100 mL,完全溶解后装入滴瓶中。 -41- (3)实验实验 步骤骤 淀粉溶液流经经固定化酶柱:将灌注了固定化酶的注射器放在 注射器架上,用滴管加淀粉溶液,使该该溶液以0.3 mL/min的流速过过 柱。 接取流出物:待从固定化酶柱中流出5 mL后接收 0.5 mL 流出 液。 流出物鉴鉴定:向流出液中加入12滴KI-I2溶液,观观察颜颜色。用 水稀释释1倍后再观观察颜颜色。 洗涤涤:保存固定化酶柱。实验实验 后,用10倍柱体积积的蒸馏馏水洗 涤涤此柱,放置在4 冰箱中保存。 几天后取出冰箱中的该该固定化酶柱,重复上述实验实验 ,观观察结结果 。 -42- (4)实验结实验结 果 (5)实验结论实验结论 固定化-淀粉酶能将淀粉水解成糊精。 -43- 下面是关于固定化酶和细菌培养实验的问题。请回答下列问题。 (1)某兴兴趣小组组欲利用固定化酶进进行酶解淀粉的实验实验 ,分组见组见 下 表。 将吸附了-淀粉酶的石英砂装入柱中后,需用蒸馏馏水充分洗涤涤固 定化酶柱,以除去 。按上表分组组,将配 制好的淀粉溶液加入到固定化酶柱中,然后取一定量的流出液进进行 KI-I2检测检测 。若流出液呈红红色,表明有 生成;若各组组呈现现 的颜颜色有显显著差异,则则流出液中淀粉水解产产物浓浓度最高的是 组组。 未吸附的-淀粉酶 糊精 -44- (2)下列关于上述固定化酶实验实验 的叙述,错误错误 的是 。 A.固定化酶柱长长度和淀粉溶液流速决定了酶柱中酶的含量 B.淀粉溶液流速过过快会导导致流出液中含有淀粉 C.各组实验组实验 所用的淀粉溶液浓浓度应应相同 D.淀粉溶液的pH对实验结对实验结 果有影响 (3)现现有一份污污水样样品,某兴兴趣小组组