高效液相色谱法应用讲座课件

高效液相色谱法应用讲座 台州市药品检验所 曾茂法 1、HPLC概述 2、HPLC实验操作应知 3、HPLC常见问题与思考 主要内容 HPLC实验操作应知 HPLC操作操作流程 流动相的配制 色谱柱使用与维护 实验操作注意事项 检测器 数据处理 1 概述 定义 分离模式与主要分离机制 基本术语 正相与反相色谱 HPLC的特点 问题思考 定义 HPLC用高压输液泵将规定的流动相 泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定 的色谱方法。 仪器结构简介 仪器组成 根据需要配置流动相在线脱气装置、梯 度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应 系统等。 附：高效液相色谱仪流程图附：高效液相色谱仪流程图 1 1贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质） 2 2高压泵高压泵（输液泵）（输液泵） 3 3进样装置进样装置 4 4色谱柱色谱柱分离分离 5 5检测器检测器分析分析 6 6废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器 7 7记录装置记录装置 泵 1.2 HPLC分离模式与主要分离机制 分离模式主要保留机制 液-固吸附吸附剂的表面吸附 键合相溶质在两相间的分配或溶质与极性固 定相的吸附 离子交换溶质离子与填料上的反电荷层之间的 相互作用 离子对电中性离子对在两相间的分配 分子排阻基于流体动力学体积的过滤作用 手性溶质手性异构体与填料手性作用点间 非对应异构体相互作用。 亲和溶质与固定化配体间生化专属结合 正相色谱法与反相色谱法 正相色谱法 反相色谱法 正相与反相 正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高中 中低 流动相极性 低中 中高 组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出 正相：流动相极性，洗脱能力，k ， 组分tR 反相：流动相极性，洗脱能力，k， 组分tR 1.3特点 适用范围宽：现在绝大部分化学类药品 皆可采用该仪器分析。 分离效率高：复方分析、辅料干扰时等 情况下，更显示其威力。 速度快：一般出峰时间均在30min以内 。 灵敏度高：可检测物质达10-9g左右，一 般最低检测浓度均可达10-110-3g/ml（ 进样体积1020l）。并可通过使用不同 的检测器，测定不同物质，或再提高测 定灵敏度。 色谱柱可反复使用：一般保存好，均可 达2年以上。 流出的组分容易收集：可用于制备色谱 或价格极为昂贵的物质收集。 安全：仅有一些有机溶剂的污染（使用时 ，流动相口要密封，一者以免挥发，流动 相中各组分比例不准，二者防止挥发，污 染环境），比气相要安全的多。 1.4 思考 1、为什么说分离度与重复性是系统适应性试 验指标中是更具有实用意义的参数？ 2、影响柱效的因素有哪些？ 3、影响分离度的因素有哪些？ 4、影响重复性的因素有哪些？ Rs 仪器 影响分离的因素影响分离的因素 1 思考 psi、bar、Mpa如何换算？ 乙醇为什么不常用作流动相？ 2、HPLC操作操作流程 开机 最后开检测器 配制流动相 流动相平衡，在此过程和适当时候调节柱温、 流速、流动相比例。必要时要选柱子。配制对 照品、样品溶液。 系统适应性试验 进样 数据处理 关机 先关检测器，后冲洗 流动相的配制 流动相应具有的特点 流动相脱气 流动相过滤除去微粒 流动相贮存 流动相极性与截止波长 流动相调pH值 思考题 流动相具备以下的特点： a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证 样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中 )。 b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学 反应(特殊情况除外)。 c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长 的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱 压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度 的方法降低流动相的黏度)。 d、流动相的物化性质要与使用的检测器 相适应。如使用UV检测器，最好使用对 紫外吸收较低的溶剂配制。 e、流动相沸点不要太低，否则容易产 生气泡，导致实验无法进行。 流动相为什么要脱气 流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中 溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当 流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而 产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏 度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致 样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解 而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成 荧光猝灭。 常用的脱气方法比较 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比 空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成 本高。 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且 有毒性挥发污染。 抽真空脱气法：易抽走有机相。 常用的脱气方法比较 超声脱气法：流动相放在超声波容器中 ，用超声波振荡10-15min，此法效果最 差。 在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱 机利用膜渗透技术， 在线脱气，智能控 制，无需额外操作，成本低，脱气效果 明显优于以上几种方法，并适用于多元 溶剂体系。 压力、温度与气泡 压力减少时要产生气泡 温度升高时要产生气泡 防止产生新的气泡 沿管壁缓缓倒入 先混合后脱气 梯度洗脱预先“部分混合” 为什么要滤除微粒 为什么溶剂和样品要过滤? 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔 很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱 柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进 样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内 的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 要正确选用滤膜 流动相的贮存 流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或 不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中 。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发 引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶 入流动相。 磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽 量新鲜配制使用，不要贮存。如确需贮 存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用， 用前应重新滤过。 流动相的贮存 容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液 和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质 沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防 腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。 6，流动相常用溶剂的极性和截止波长 由极性可以看出，在反相色谱中，要使出峰时间加快， 可增加流动相中的乙腈比例，但要注意分离度的减小；若要 使出峰时间减慢，可增加流动相中水的比例，增加水的比例 还会引起分离度的增加；两者之间综合来考虑。四氢呋喃使 用时注意波长。必须选用色谱级的。 由于甲醇的极限波长为210nm左右，故短波长测定时 ，最好不要采用甲醇，而用乙腈。 样品稀释用溶剂的选择：测定有关物质时最好选用流 动相，避免以溶剂峰的干扰，水往往出倒峰。 各溶剂截止波长 流动相的pH值 采用反相色谱法分离弱酸（3pKa7） 或弱碱（7pKa8）样品时，通过调节 流动相的pH值，以抑制样品组分的解离 ，增加组分在固定相上的保留，并改善 峰形的技术称为反相离子抑制技术。对 于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k 值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值 时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱 ，情况相反。 分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱 酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶 液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少 量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和 30mmol/L三乙胺溶液。 注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质 与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖 尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺 ）又称为减尾剂或除尾剂。 流动相的配制 缓冲盐溶液 浓度不要配错 ，临用新配 调PH时一般在水相调，当流动相中有机 相比例较高时无法调。 思考题 1、流动相流速与组成与保留时间的关系 如何？ 2、流速与柱效、峰面积的关系 3、乙腈与甲醇在应用上的区别。 4、水与有机相混合比例不同，会引起粘 度变化吗？ 5、流动相有时为什么要调pH？ 6、流动相配好后可用多长时间？ 色谱柱的使用与维护 阅读说明书 安装时注意方向 如何排气泡？ 反相柱C-18或C8当用含缓冲盐或表面活性 剂的流动相后，要冲洗干净。 色谱柱的使用与维护 色谱柱不用、存放时，两头柱塞一定塞住，防 止柱内溶剂挥干,否则容易挥发干损伤柱子。 分析生化样品、血液制品和手性色谱柱时，最 好加一预柱以保护。 流动相极性及流速（压力）不要突变。 （1）色谱柱不能够碰撞、弯曲或强烈震荡 ；安装时，一定要保证阀件或管路的清 洁。 （2）尽量不使用或少使用高粘度的流动相 。 （3）在满足灵敏度的情况下，尽可能使用 小进样量。如果样品比较“脏”，要进行 净化或提纯处理。 柱温控制 柱温箱的作用： 1、保留时间精确再现 2、提高分离效率 3、对高分子化合物或黏度大的样品，分析 时柱温必须高于室温。 4、对一些具有生物活性的生物分子，要求 低的柱温 系统平衡 1.除上所述外，流动相配制时还需注意什么？ 2.流动相冲洗多长时间平衡？如何平衡？ 3.有表面活性剂时小流速过夜，再到规定流速 30min。 4.基线什么情况下才算平衡？ 配制样品和对照品溶液 2配制：溶剂；容器：塑料容器常含有 高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污 染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。 某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸 附，影响样品中药物的定量回收。 3 对照品称量问题 预试 预试目的 n，R是否符合要求； 保留时间是否合适 调节色谱条件 流动相组成 流速 柱温 柱子 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不 同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的 色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速 。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择 1mlmin，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml min为佳。 当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可 采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析 时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈 的含量)。 流速和柱温均可适当改变，以适应测定 的需要。如含量测定时，可适当加大流 速和提高柱温；改变柱温和流速降低均 可提高分离效果。 第一次测定时，应先将空白溶剂、对照 品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量 收集较长时间的图谱（如30分钟以上） ，以便确定样品中被分析组分峰的位置 、分离度、理论板数及是否还有杂质峰 在较长时间内才洗脱出来，确定是否会 影响主峰的测定。 4进样量：药品标准中常标明注入10ul 而目前多数HPLC系统采用定量环（10ul 、20ul和50ul），因此应注意进样量是否 一致。（可改变样液浓度） 系统适应性试验 含量测定对照品2份,样品2 份;有关物质, 对照品一份,样品一份。 每份对照品进样三次，计算RSD%。系 统适应性符合要求后，再进样。或者一 份对照品先进5针，计算RSD%符合要求 ，实验过程或实验结束进另一份对照品 核对，范围应在98%102%之间 样品测定 含量测定样品2 份，每份1针;有关物质样 品1份, 每份2针。 为了考察系统在实验过程中的稳定性。适 当间隔再进标样核对。 有关物质检查时，空白应进1针。含量测 定可不做。 自身对照进几针？ 10.3应尽量保持样品溶液和对照品溶液使 用同一溶剂。含量测定时一般可以做到，溶 出度测定时，往往有所差异，通过先浓配后 ，再用该溶剂稀释的办法进行，比例尽可能 小。 仪器冲洗 如何冲洗 一般溶剂 缓冲 梯度 检测器类型 最通用的紫外检测器：注意测定波长较短时 ，基线有可能会飘；洗柱子时，尽量关闭光源， 以延长使用寿命。 二极管阵列检测器：目前使用者越来越多。 用于多波长检测、峰纯度测定、对被测定物质进 行紫外扫描后选择波长等用途。 10. 二极管阵列检测器的应用 采用二极管阵列检测器进行论证，也是目前常采用的一个强有力 的手段。它通过对一个色谱峰的数点进行紫外扫描，然后比较所得到 的扫描图谱的接近程度从而评价被检测峰的纯度。 利用二极管阵列检测器进行峰纯度检查的缺点： （1）杂质浓度低，或与主成分相比吸收太小，达不到检测 灵敏度，无法检测出来。 （2）当杂质的发色团与主成分一致，或者说杂质与主组分 有相同或几乎相同的光谱图且具相近的流出时间，此时杂 质也无法发现。 荧光检测器：灵敏度更高，对那些g级 的制剂品种，有时适用。但缺点是，基 线稳定需平衡时间较长。 示差折光检测器、蒸发光散射检测器 、电化学检测器（电导检测器）等。 检测 最小峰面积的设定 峰纯度的测定 自身对照法与归一化法的区别 结果计算 8定量分析 8.1 外标法：计算公式： 使用时应注意尽量保持样品溶液和对照品溶液浓度相同 8.2 内标法：计算公式： 8.3 归一化法和自身对照法：为有关物质（杂质）的测 定方法。这是通过峰面积的比较来推算出各物质质量 比例的方法。目前多采用自身对照法来进行。 (1) 归一化法：即一个峰的峰面积（杂质峰）占总峰面积 或占主峰面积的多少。由于有关物质测定时，总峰面 积的绝大部分均为主峰面积，故两者结果差不多，结 果基本一致。 (2)自身对照法：通常是将供试品溶液稀释一定 倍数后（通常为100倍）作为对照溶液（这里对 照溶液与对照品溶液的区别需要强调一下）， 将其和供试品溶液分别进样测定，供试品溶液 色谱图中的每个杂质峰面积，与对照溶液主成 分峰面积进行比较或计算进行对杂质的判断。 如比较，直接比峰面积大小，如计算，则采用 公式计算杂质含量 。 如果该物质线性关系良好，稀释100倍，峰面积还呈线性 的话，那么，归一化法和自身对照法所得结果基本是一 致的（最多差0.02%左右）。但如果稀释100倍，峰面积 不呈线性的话，那么，归一化法和自身对照法所得结果 将有所差异，如此时采用归一化法，将得不到较为正确 的结果，因为此时，峰面积已不能较为准确地表示质量 ；而采用自身对照法，则可避免该情况的发生，这也是 目前推荐采用该法的原因所在。 用紫外检测器，一般化合物的线性范围可达 1106或107，但也有一些测定物质，线性范围 较窄，此时便需要摸索其范围，但又不能单纯 考虑线性范围，还应着重考虑供试品溶液的浓 度才是最为重要的。 制剂测定中注意事项： 1. 紫外鉴别中辅料的干扰，易使最大吸收波长偏离。 2. 含量均匀度 采用先加水浸泡使溶涨，再超声使崩散，再加 有机溶剂使主药溶解的办法进行，准确、可靠、易行。 3. 溶出度测定时如灵敏度不够，可通过加大进样量的 办法解决。 对照品溶液配制、测定值偏高、过滤损失等问题一 定要注意。 4. 含量测定浓度设定得尽可能低些。测定值与投料量 的吻合性。色谱条件可与有关物质测定时的不一致。 5. 有关物质注意辅料的影响，可规定主峰保留 时间几倍前的辅料峰不计。单个杂质的设定。 6 勿需去除薄膜衣、糖衣！ 2.5 中国药典具体品种存在问题举例： 1. 甲硫酸新斯的明注射液 含量测定采用定氮法；BP同品种采 用UV、E值法测定，方法简便、易行。 2. 甲磺酸酚妥拉明及其注射液 含量测定均采用沉淀法，经多 次操作后测定，该法费时费力，且易造成损失、使结果偏低 ；BP和USP同品种均采用氢氧化四丁基铵直接滴定的方法， 操作简便、易行。 克霉唑 含量测定采用对照品、容量分析滴定法测定。但 未给出滴定度，故滴定时不知该选用何种体积的滴定管 和大约消耗的体积数，使试验人员需经多次试验进行摸 索，浪费了人力、物力。 4. 酮康唑乳膏含量测定采用有机溶剂多次提取，费 时费力，且必造成一定的损失（至少5%）。应改为采 用甲醇破坏基质、溶解主药后，离心，取上清液直接进 行HPLC法测定，结果准确、可靠，便于操作。 5.盐酸布比卡因注射液含量测定极为烦琐 ，费时费力；BP和USP同品种采用HPLC法测 定，方法简便、易行。 6. 提高办法，及时更改、完善! 思考：下图说明什么？ 找原因 如图所示：同一份溶 液进样两次。 怎么会多出一个峰 同一样品两份溶液， 各自进样，出现图示 结果 什么原因？ 找原因 图示：上图为空白溶 剂。中图为样品溶液 。下图为自身对照。 什么原因？ 主峰不见了 右图为空白溶剂图谱 实验人员说在样品的 图谱上主峰不见了， 怎么回事？ 提高分离度有什么途径？ 增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样 会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降 低塔板高度，提高柱效。 增加选择性。当1时，R0，无论柱效有 多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下 措施来改变选择性： a. 改变流动相的组成及pH值； b. 改变柱温 c. 改变固定相。 提高分离度有什么途径？ 改变容量因子。这常常是提高分离度 的最容易方法，可以通过调节流动相的 组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k2 增大，R也增大。但k2不能太大，否则不 但分离时间延长，而且峰形变宽，会影 响分离度和检测灵敏度。一般k2在110 范围内，最好为25，窄径柱可更小些。 为什么要梯度洗脱 样品的保留范围宽 样品分子量 样品中含强保留成份 样品稀溶液的柱上浓 缩 梯度洗脱时应注意什么问题？ 要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶 剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶 剂在一定比例内混溶，超出范围后就不 互溶，使用时更要引起注意。当有机溶 剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶 体，尤其使用磷酸盐时需特别小心 梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高， 以保证良好的重现性。进行样品分析前 必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂 质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱 柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度 洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时 产生气泡。 梯度洗脱时应注意什么问题？ 混合溶剂的粘度常随组成而变化，因 而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例 如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近 比例混合时粘度增大很多，此时的柱压 大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因 此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过 输液泵或色谱柱能承受的最大压力。 梯度洗脱时应注意什么问题？ 每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处 理，使其恢复到初始状态。 1.在100%B结果运行一定时间(2 5个柱体积)以洗脱 干扰物,或在每次分析结束后,快速自最终B%结果运 行一梯度至于100%B并维持一段时间 柱平衡:指用起始流动相冲洗色谱柱达到两相平衡 。在每次进样前，用同方法及时间平衡色谱柱。 方法：510柱体积（715ml，对150mm4 .6mm）。也可 用反梯度平衡稳固需让1030倍柱容积的初始流动相流经 色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。 梯度洗脱时，基线为什么漂移 在梯度洗脱中，基线漂移是常见的，尤其是低 检测波长时更为严重。这是由于A和B溶剂UV 吸收不同造成的。 这种UV吸收相关的漂移可用吸收匹配法消除 。向A溶剂加UV吸收物。 注意：用UV低波长及高灵敏度检测时，运行 空白试验，在色谱图中常常会出现一些“非样 品峰，这些峰来自流动相及污染的色谱系统。 与检测器有关的故障及其排除 1）流动池内有气泡 如果有气泡连续不断地通过流动池，将使噪 音增大，如果气泡较大，则会在基线上出现许 多线状“峰“，这是由于系统内有气泡，需要对 流动相进行充分的除气，检查整个色谱系统是 否漏气，再加大流量驱除系统内的气泡。如果 气泡停留在流动池内，也可能使噪音增大，可 采用突然增大流量的办法除去气泡（最好不连 接色谱柱）； 与检测器有关的故障及其排除 或者启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出 口，使池内增压，然后放开。可反复操作数次 ，但要注意不使压力增加太