高效液相色谱质谱联用技术原理与应用课件

高效液相色谱-质谱联用 技术原理与应用 什么是液质联用(LC/MS) nLC: 液湘色谱仪 一种能够把液体混合物中的不同组分根据 在色谱柱中保留时间不同进行分离,检测及收集 的仪器 nMS: Mass Spectrometer 质谱仪 一种能够把分子转化生成带电离子,并在 气态中根据质荷比(m/z : m质量 z分子所带电荷 数 )的不同把离子进行分离并进行检测的仪器. n质谱分析过程：样品通过进样系统进入离子源，由于结构 性质不同而电离为各种不同质荷比（m/z）的分子离子和 碎片离子，而后，带有样品信息的离子碎片被加速进入质 量分析器，不同的离子在质量分析器中被分离并按质荷比 大小依次抵达检测器，经记录即得到按不同质荷比排列的 离子质量谱，也就是质谱 (mass spectrum)。 n质谱：按离子的质荷比的大小依次排列形成的图谱 质谱技术： M1 M2 (M1+1)+ (M2+1)+ (M1+1)+ (M2+1)+ 离子源 准分子离子 (M+1)+ 多电荷离子 (M+nH)n+ 质量分析器 质谱分析系统的基本组成 真空系统 进样系统离子检测器 数据采集 系统 离子源 大气压 质量分析器 真空系统 机械泵 10-3 - 10-4 torr (1atm =760 torr) 分子扩散泵 10-6 torr 涡轮分子泵 10-9 torr 离子泵 10-11 torr 升华泵 真空系统是任何MS的基础 理想的真空系统是 -高性能 快速 干净 安全可靠 离子检测器 离子源 数据采集 质量分析器 进样系统 离子检测器 离子源 数据采集 质量分析器 进样系统 储罐进样 储气室、加热器、真空连接系统和分子漏孔 色谱进样（气/液质联用） （气/液）相色谱出口直接导入 探头进样 样品室、玻璃毛细管，探头 注射器进样 毛细管电泳进样 1 电子轰击电离(EI) GC/MS 2 化学电离(CI) GC/MS 3 大气压化学电离(APCI) LC/MS 4 快原子/离子轰击(FAB/SIMS )离子源 5 等离子体解吸(PD) 6 基质辅助激光解吸电离(MALDI) 7 电喷雾电离(ESI) LC/MS 8 场致电离 - Field ionization 9 火花放电 - Spark source 10 激光电离 - Laser ionization (LIMS) 11 共振电离Resonance ionization(RIMS) 12 热电离 - Thermal ionization (TIMS) 离子检测器 离子源 数据采集 进样系统 质量分析器 Turbo Turbo V Vtm tm 离子源 离子源 ( API 3200, API 4000, ( API 3200, API 4000, 和和 API 5000)API 5000) 辅助气加热 头 TIS or APCI 离子探头 液体进入口 垂直精密调节 旋钮 水平精密调 节旋钮 两通或三通 离子源排气口 喷雾针出口 APCI电晕针 Turbo VTM 离子源 电喷雾(ESI)离子源工作原理 电喷雾离子化分为三个过程: (液态带电） 1 形成带电小液滴 2 溶剂蒸发和小液滴碎裂 3 最终形成气相离子 离子源的选择-ESI 优点 n适合范围广:分析离子型/极 性化合物、难挥发或热不 稳定性化合物 n 多电荷离子的形成，可以 分析高分子量化合物 n灵敏度高 缺点 n在溶液中必须形成离子 n流动相中缓冲盐的种类和 浓度对灵敏度均有显著影 响，因此流动相的选择非 常重要 n具有流速依赖性 n基质抑制现象较为明显 APCI 三步离子化的过程(气态带电） 1. 溶剂快速蒸发形成气态分子 2. 电晕针放电使离子源内溶剂带电 3. 带电的溶剂离子与组分气态分子发生电荷转移，生 成分子离子 大气压化学电离源大气压化学电离源 (APCI) (APCI) 又叫又叫: :加热雾化加热雾化 源源 Heated NebulizerHeated Nebulizer 离子源的选择- APCI 优点 n有一定挥发性的中等极性 或低极性的小分子化合物 n对溶剂选择、流速和添加 物的依赖性较小 缺点 n有可能发生热裂解 n样品需要有一定的挥发性 n适合分析分子量小于 2000 Da 的样品 离子源 3.6e4 Intensity, cps Mometasone Minoxidil TIS 0.51.01.52.02.53.03.5 Time, min 0.0 4.0e4 Intensity, cps 0.51.01.52.02.53.03.50.0 Time, min Mometasone Minoxidil APCI 离子检测器 离子源 数据采集 质量分析器 进样系统 1 扇形磁场和静电场质量分析器 2 傅里叶变换离子回旋共振 3 飞行时间分析器 4 四极杆分析器 5 离子阱分析器 + + + + + _ A BB A To Detector 去检测器 A AB B 离子簇在离子通道的运动模式 电压使离子簇以螺旋运动的方式前进 RF only-A rods & B rods are 180 out of phase 只加交流信号-A杆与B杆上 加的电压强度相同,相位差180度 离子肼的工作原理离子肼的工作原理 B 应用 n制药：合成过程中中间体、成品的结构鉴定，杂质分析 n天然药物与中药分析：结构鉴定，质谱规律，中药药效 物质基础 n药物代谢药物动力学：药动学 药物代谢物寻找 n代谢组学 n蛋白组学（生物大分子分析） n烟草 n食品分析 n公安毒物检查 n体育兴奋剂检测 n中药中非法添加化学药 n新生儿筛查 制药行业 n合成过程中中间体、 成品的结构初步鉴定 n杂质分析 液质联用分析美伐他汀的有关物质 制备液相分离，核磁确证结构 n天然产物与中药分析 蟾酥药材HPLC/DAD/APCI- MS/MS 定性定量分析方法 l从蟾酥药材中共鉴定了35 个蟾毒内酯类成分, 其中4 个成分为首次发现。 l通过进一步实验, 分别对17 个蟾毒内酯类化合 物进行多极质谱(MSn , n=2- 4) 裂解方式研究, 根据化学结构和裂解规律将蟾毒内酯类化合物 分为5 类。 l蟾酥药材中8 个主要蟾毒内酯类成分进行了定量 分析。 l不仅可以快速、灵敏地分析蟾毒内酯类成分, 还 能够对蟾酥药材及相关制剂进行有效的质量控 制。 nZorbax SB-C18色谱柱保护柱 n流动相：(A)乙腈-(B)0.3%醋酸 水溶液 0-20 min ：A 25%-30%，B 75%-70% 20-37 min：A 30-50，B 70-50 37-45 min：A 80%，B 20% n流速：1.0 mlmin-1 n检测波长：275 nm n全波长扫描范围：190-400 nm n柱温：40 液相色谱条件质谱条件 ESI源 n负离子检测 n扫描范围：80-1000 m/z n鞘气流：50 arb n辅助气流：15 arb n源电压：5.00 kV n毛细管温度：350 n毛细管电压：-12.00 V n管透镜补偿电压：- 10.00 V HPLC-MS技术定性分析生物样品、降香药 材中黄酮类成分 No.tR (min) M-H- (m/z) max (nm) Identity 17.06269220,2923-hydroxydaidzein 27.90271232,278butin 38.632993403-hydroxymelanettin 410.44301280(3R)-4-methoxy-2,3,7- trihydroxyisoflavanone 511.58299240,290koparin 612.54255230,276,31 0 liquiritigenin 713.80283294melanettin 815.89283286,3502,7-dihydroxy-4,5- dimethoxyisoflavone 915.89313290stevenin 10 18.27315274,310violanone 1119.13271262butein 1220.83285278,312vestitone 1323.64283248,2902-hydroxyformononetin 1429.88255240,372isoliquiritigenin 1531.13267250,302formononetin 1631.73267232,352dalbergin 1732.89329232,274,32 0 3-O-methylviolanone 1834.17299230,276,31 0 sativanone 1935.69269228,286medicarpin 2037.42255232,290pinocembrin 2138.40283260prunetin 2240.972604methoxydalbergione 采用HPLC-MS 对黄酮类化合 物对照品以及 降香总黄酮的 体外、体内分 析结果 22 authentic compounds (HPLC-UV) authentic compounds (TIC-MS) 对照品的HPLC-MS色谱图 22 the total flavonoids of D. odorifera (HPLC-UV) the total flavonoids of D. odorifera (TIC-MS) 降香总黄酮的HPLC-MS色谱图 serum sample with enzyme hydrolysis serum sample without hydrolysis blank serum 大鼠口服降香总黄酮后血清样品的TIC-MS色谱图 18 18 血清 TIC-MS 大鼠口服降香总黄酮后尿样的TIC-MS色谱图 blank urine urine sample without hydrolysis urine sample with enzyme hydrolysis 18 18 尿样 TIC-MS 大鼠口服降香总黄酮后肝脏样品的TIC-MS色谱图 blank liver liver sample without hydrolysis liver sample with enzyme hydrolysis 16 16 肝脏 TIC-MS blank kidney kidney sample without hydrolysis kidney sample with enzyme hydrolysis 大鼠口服降香总黄酮后肾脏样品的TIC-MS色谱图 17 18 肾脏 TIC-MS blank lung lung sample without hydrolysis lung sample with enzyme hydrolysis 大鼠口服降香总黄酮后肺脏样品的TIC-MS色谱图 7 7 肺脏 TIC-MS 大鼠口服降香总黄酮后心脏样品的TIC-MS色谱图 blank heart heart sample without hydrolysis heart sample with enzyme hydrolysis 10 10 心脏 TIC-MS 大鼠口服降香总黄酮后脾脏样品的TIC-MS色谱图 blank spleen spleen sample without hydrolysis spleen sample with enzyme hydrolysis 7 12 脾脏 TIC-MS n中药制剂中掺入西药成分分析 液质联用分析中药降糖制剂中掺入 的西药成分 n药物代谢与药物动力学 Intensity, cps Intensity, cps Intensity, cps Intensity, cps (A)(A) (B)(B) (C)(C) 空白血浆样空白血浆样 品色谱图品色谱图 空白血浆添加内 酯苷和芍药苷的 色谱图 大鼠灌服白芍总 苷溶液后血浆样 品色谱图 内酯苷内酯苷 栀子苷栀子苷 芍药苷芍药苷 5.83 6.5 5 4.5 3 芍药苷和芍药内酯苷同时测定多离子反应监测色谱图芍药苷和芍药内酯苷同时测定多离子反应监测色谱图 白芍总苷药动学研究白芍总苷药动学研究 给予大鼠白芍总苷水溶液，剂量给予大鼠白芍总苷水溶液，剂量 162 162 mg/kgmg/kg，相当相当 于芍药苷于芍药苷53.36 mg/kg 53.36 mg/kg 和和 15.21mg/kg15.21mg/kg。 单体给药和给予白芍总苷后芍药苷药动学参数比较，单体给药和给予白芍总苷后芍药苷药动学参数比较，C Cmax max、 、TmaxTmax无显无显 著性差异，著性差异， AUCAUC0- 0-t t 、t t 有有显著性差异。说明芍药苷动力学过程受白芍显著性差异。说明芍药苷动力学过程受白芍 总苷中其他成分的影响。总苷中其他成分的影响。 比较低剂量芍药内酯苷单体和白芍总苷的药动学参数，结果表明比较低剂量芍药内酯苷单体和白芍总苷的药动学参数，结果表明 两种给药形式下芍药内酯苷的两种给药形式下芍药内酯苷的C Cmax max、 、T Tmax max、 、AUCAUC0-t 0-t与 与t t1/2 1/2之间无显著 之间无显著 性差异，即芍药内酯苷药物动力学过程不受白芍总苷中其他成分性差异，即芍药内酯苷药物动力学过程不受白芍总苷中其他成分 的影响。的影响。 n中药药效物质基础与配方原则研 究 单煎液和共煎液 汤剂 复方 配伍原则 君(King)： 提供主要治疗作用 臣( Minister ) 佐( Assistant ) 起加强, 调和, 辅助君药功能的作用 使( Servant) 化学反应 传统中药 附子（The roots of Aconitum Carmichaeli debx ，RAC） 在中国被广泛用于抗风湿、止痛等 RAC, 君 臣 佐 使 X X X Bletilla pinellia frilillary 白芨 半夏 贝母 + liquorice ginger white penoy 甘草 干姜 白芍 为增效减毒, 附子经常与甘草(liquorice),干姜 (ginger),白芍,(white peony)和人参等(ginseng) 共同使用 (这里称第一类中药，group I), 尤其是 甘草，中医千百年的医疗实践表明它具有广泛的 解毒作用 与一类中药相反，半夏(pinellia tuber),贝母 (frilillary bulb) 或白芨(bletilla tuber)等禁止与附 子共用，这里称第二类中药(group II of herbs) 含附子组方的配伍原则含附子组方的配伍原则 质谱分析 1. 通过ESI-MS，鉴定了生附子中的生 物碱:双酯型生物碱及脂碱的结构 2. 附子煎煮前后所含生物碱的对比以 及煎煮过程中所发生的反应 3. 附子与其他草药共煎生物碱含量 的变化 4. pH值对于反应的影响 附子+水 附子+ 甘草 DDA MDA DDA MDA 附子+半夏 DDA MDA n n 公安、司法鉴定公安、司法鉴定 LC-MS/MS技术在法庭科学中的应用 n毒品/滥用药物：可卡因、海洛因、吗啡 、摇头丸、迷幻药等等 2001年1-6月缴获海洛因6201千克、鸦片 1927千克、冰毒2970千克、摇头丸64万粒、度 冷丁1400支、咖啡因80千克、罂粟壳40吨、易 制毒化学品72吨 n毒物：鼠药、农药、工业毒物、药物毒物 、蛇蝎蜂毒、河豚毒素及其它海洋生 物毒素、植物毒素等等 n爆炸物：硝化甘油、OCTOGEN、HMX、EGDN 、HEXOGEN、RDX、NG、TETRYL、DNT和 PETN等等 n其它化合物：案发现场遗物如油漆、血迹 、高聚物等 质谱在生物大分子研究领域中的应用 1 蛋白质和多肽的分析 2 寡核苷酸和核酸的分析 3 微生物鉴定 4 药物设计 5多糖结构测定 蛋白质和多肽的分析 ?分子量测定 ?肽谱测定 ?肽及蛋白质序列测定 ?巯基和二硫键