《细胞与免疫学技术与原理》课件

第二讲 细胞培养技术二 动物细胞培养可以在同一时期、 相同条件、相似性状的条件下提 供大量的实验样本，开展科学研 究，相对耗资较少，因而成为生 物制品、单克隆抗体和基因工程 制品生产的重要手段。 第一节第一节 动物细胞原代培养动物细胞原代培养 概念：概念：从供体获得组织细胞从供体获得组织细胞 为材料，进行首次培养，称为材料，进行首次培养，称 为细胞的原代培养或称细胞为细胞的原代培养或称细胞 的初代培养。的初代培养。 原代培养的细胞特点： （1）原始性 （2）不均一性 理论：各种动物和人体内所有组织都 可进行培养。 实际：幼体组织尤其是胚胎组织比老 年的易培养；分化程度底的组织比分 化程度高的易生长；肿瘤组织比正常 组织容易培养。 一、取 材 常用取材方法举例：常用取材方法举例： 1 1、取体液、取体液 主要指取血液，血液是白细胞的主要指取血液，血液是白细胞的 主要来源。有主要来源。有指尖取血指尖取血和和静脉取血静脉取血等等 方法。方法。 指尖取血指尖取血 2、取人体皮肤或活检材料 （1）皮肤用75%酒精消毒； （2）用刮皮刀刮取表皮，以轻微渗血为界； （3）包扎伤口，伤口好后不留疤痕。 这种取皮方法的优点是表皮细胞多，培养 容易成功。如取活检组织（小儿包皮）须先 准备含双抗的BSS液送入手术间，手术后储 4冰箱。 3、取内脏和实体瘤 内脏除消化道外基本是无菌的 ，要明确和熟悉所需组织的类型 和部位。 实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰 富的区域，要避开破溃、坏死液 化部分，以防污染。 怀孕母鼠怀孕母鼠 4、取鼠胚 1717天的胚胎天的胚胎 取完整鼠胚胎步骤取完整鼠胚胎步骤 5、取各种动物材料 先准备好一瓶含双抗的无菌PBS 液，待处死动物后，迅速取出所 需要的脏器组织，放入无菌PBS 液内，尽快将实验材料送入超净 工作台，进行细胞原代培养。 从体内取出的各种组织均由众多的细 胞和纤维成分组成，且结合十分紧密， 为获取大量生长良好的细胞，必须把组 织细胞分散开来，使细胞解离出来；能 达到单细胞水平更好，同时并不使细胞 受伤害。 二、组织分离方法 适用范围：血液、羊水、腹水和胸水等细胞 悬液。 方法：一般用5001000r/min的低速离心， 如果离心速度过大和时间太长，则易挤压细 胞使之受损或死亡。 分层液：分层液根据细胞比重不同，使各类 细胞相互分开的，红细胞比重为1.092，淋 巴和大单核等白细胞比重为1.070，分层液 适用于分离血中淋巴细胞。 1、离心分离法 离心前离心前 离心后离心后 FicollFicoll分层液离心后外周血细胞示意图分层液离心后外周血细胞示意图 2 2、机械分散法、机械分散法 适用范围：适用范围：某些软组织如脑、胚胎及一些某些软组织如脑、胚胎及一些 肿瘤组织。肿瘤组织。 组织消化法是在把组织经过切割处理后， 再用生化手段进一步分散成细胞团或单个细 胞然后加入培养液。制成细胞悬液，接种入 培养容器中后，细胞容易生长增殖，如： 3、消化分离法 胰蛋白酶消化法胰蛋白酶消化法 胶原酶消化法胶原酶消化法 EDTAEDTA消化法消化法 优点：组织和细胞刚刚离体，生物性 状尚未发生很大变化，具有二倍体遗 传性状，供体来源充分、生物条件稳 定的情况下，在一定程度上能反映在 体状态。 三、细胞原代培养方法 1 1组织块培养法组织块培养法 怀孕母鼠怀孕母鼠 1717天的胚胎天的胚胎 胚胎中取出的胚胎中取出的 成体近端小肠成体近端小肠 把粘膜切成小块把粘膜切成小块 细胞培养板细胞培养板 中贴壁培养中贴壁培养 组织块间距组织块间距1 1厘米厘米 取小鼠肠粘膜细胞贴壁培养取小鼠肠粘膜细胞贴壁培养 组织块培养法示意图 翻转培养瓶的翻转培养瓶的目的目的是为了使组是为了使组 织块微干涸，以利贴附和免从瓶织块微干涸，以利贴附和免从瓶 壁脱落，但时间不易过长，超过壁脱落，但时间不易过长，超过 4 4小时以上可能对组织有不利影小时以上可能对组织有不利影 响。响。 2、消化细胞培养法 单层培养的表皮细胞单层培养的表皮细胞 单层细胞培养示意图 胰蛋白酶冷消化法 胰蛋白酶热消化法 消化得到的细胞沉淀，用培养液消化得到的细胞沉淀，用培养液 配制成细胞悬液，接种到培养瓶内水配制成细胞悬液，接种到培养瓶内水 平放置，平放置，3737进行培养，每隔进行培养，每隔1 12 2 天换培养液一次，培养一定的时间后天换培养液一次，培养一定的时间后 ，细胞在瓶底可长成一单层。，细胞在瓶底可长成一单层。 单层培养的神经细胞（左）和内皮细胞（右） 单层细胞培养的好处：单层细胞培养的好处： （1 1）更换新鲜培养液比较容易，便于细胞）更换新鲜培养液比较容易，便于细胞 从培养液摄取营养和排除代谢产物；从培养液摄取营养和排除代谢产物； （2 2）易于观察某些因子加到培养液内后的）易于观察某些因子加到培养液内后的 作用，以及从培养液中减去某些因子后对细作用，以及从培养液中减去某些因子后对细 胞生长的影响。胞生长的影响。 （3 3）当细胞粘附在基底质上后，则更）当细胞粘附在基底质上后，则更 容易表达某些产物；容易表达某些产物； （4 4）单层细胞培养更适用许多细胞系）单层细胞培养更适用许多细胞系 。 （5 5）适合大量细胞培养。）适合大量细胞培养。 第二节第二节 动物细胞传代培养动物细胞传代培养 原代培养过程中要不断更换新鲜 培养液以维持细胞的生长。待细胞 生长到一定的限度时会产生接触抑 制，需要对细胞进行再培养。 概念：概念：由原代培养的细胞经消化由原代培养的细胞经消化 分离后，从培养瓶中取出，配制成分离后，从培养瓶中取出，配制成 细胞悬浮液，分装到两个或两个以细胞悬浮液，分装到两个或两个以 上的培养瓶中继续培养，称为细胞上的培养瓶中继续培养，称为细胞 传代培养或再培养。传代培养或再培养。 传代培养形成的细胞群称传代培养形成的细胞群称细胞细胞 系系。细胞系虽然比原代培养物的。细胞系虽然比原代培养物的 细胞组成均一得多了，但它仍不细胞组成均一得多了，但它仍不 是单一细胞。必须在细胞系的基是单一细胞。必须在细胞系的基 础上进行单细胞的克隆化、筛选础上进行单细胞的克隆化、筛选 而形成而形成细胞株细胞株。 一、需要更换新鲜培养液的一、需要更换新鲜培养液的 提示提示 1 1、培养液的、培养液的pHpH值下降值下降 2 2、细胞浓度、细胞浓度 3 3、细胞类型、细胞类型 4 4、细胞形态学、细胞形态学 二、传代培养的确定 1 1细胞生长停滞，继而细胞出现脂细胞生长停滞，继而细胞出现脂 肪滴、衰老或者组织块脱离基质漂肪滴、衰老或者组织块脱离基质漂 流在培养液中。流在培养液中。 2 2正常细胞生长贴满瓶壁后，由正常细胞生长贴满瓶壁后，由 于正常细胞表面具有于正常细胞表面具有接触抑制接触抑制，因，因 而细胞生长受抑制。而细胞生长受抑制。 3. 3. 肿瘤细胞生长可形成多层细胞肿瘤细胞生长可形成多层细胞 。多层细胞中，在低层部位的细。多层细胞中，在低层部位的细 胞与培养液不能直接触，结果由胞与培养液不能直接触，结果由 于营养不足而生长停滞，甚至细于营养不足而生长停滞，甚至细 胞呈片状脱离瓶底而漂浮在培养胞呈片状脱离瓶底而漂浮在培养 中。中。 三、三、传代培养的方法传代培养的方法 1 1、单层细胞的传代培养、单层细胞的传代培养 （1 1）轻轻震荡法）轻轻震荡法 （2 2）用胰蛋白酶消化液处理）用胰蛋白酶消化液处理 （3 3）用）用EDTAEDTA溶液溶液 （4 4）机械刮削法）机械刮削法 消化法传代培养步骤消化法传代培养步骤 悬浮细胞的传代培养，不需要解离细悬浮细胞的传代培养，不需要解离细 胞一步，可直接用离心法得到细胞，胞一步，可直接用离心法得到细胞， 然后将细胞悬于新鲜培养液内，计数然后将细胞悬于新鲜培养液内，计数 ，分装培养瓶，再培养。，分装培养瓶，再培养。 2、悬浮细胞的传代培养 原代培养所含的细胞类型多而杂，培养初 期细胞类型多种多样。随着培养时间的延长 ，有的细胞类型经过适应生长阶段而加速繁 殖生长；而另一些细胞，或者死亡，或者经 过逐步退化而至死亡。培养物的细胞类型由 复杂逐步变为单一的或均匀的。 四、细胞系的建立 传代培养不仅仅是为了维持细传代培养不仅仅是为了维持细 胞不断地生长，而且使培养物逐胞不断地生长，而且使培养物逐 步演变为具有增殖能力、特征专步演变为具有增殖能力、特征专 一、类型均匀的培养细胞，称之一、类型均匀的培养细胞，称之 为为细胞系细胞系。 “有限”细胞系：寿命有限的细胞系 。这类细胞系大多经过有限的细胞代 数后，一般经2080群体倍增后，细 胞退化或死亡，其寿命长短与细胞类 型和培养条件有关。 “无限”细胞系：经过再培养传代后 ，细胞发生转化，可连续培养和生长 ，寿命变为“无限”的，称谓连续培养 细胞系，或“无限”细胞系。 第三节第三节 培养细胞的生物学特性培养细胞的生物学特性 一、培养细胞的形态分类一、培养细胞的形态分类 1 1、贴附型、贴附型 只依赖于贴附才能生长的细胞称贴只依赖于贴附才能生长的细胞称贴 附性细胞或锚着依存性细胞。附性细胞或锚着依存性细胞。 （1 1）成纤维型细胞）成纤维型细胞 皮肤成纤维细胞（ 100 倍） 成纤维型细胞，细胞体呈梭形或成纤维型细胞，细胞体呈梭形或 不规则三角形，中央有卵圆形核，不规则三角形，中央有卵圆形核， 胞质向外伸出胞质向外伸出2 23 3个长短不同的突个长短不同的突 起。细胞在生长时多呈放射状、火起。细胞在生长时多呈放射状、火 焰状或旋涡状走行。在培养中的细焰状或旋涡状走行。在培养中的细 胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆 可称之为可称之为成纤维细胞成纤维细胞。 （2 2）上皮型细胞）上皮型细胞 培养的血管内皮细胞 3 3、游走型细胞、游走型细胞 游走型细胞在支持物上散在生长，一游走型细胞在支持物上散在生长，一 般不连接成片。细胞质经常伸出伪足或般不连接成片。细胞质经常伸出伪足或 突起，呈活跃的游走或变形运动，速度突起，呈活跃的游走或变形运动，速度 快而且不规则。此型细胞不很稳定，有快而且不规则。此型细胞不很稳定，有 时亦难和其它型细胞相区别。在一定条时亦难和其它型细胞相区别。在一定条 件下，由于细胞密度增大联接成片后，件下，由于细胞密度增大联接成片后， 可呈类似多角形。可呈类似多角形。 （4 4）多形型细胞）多形型细胞 除上述三型贴附型细胞外，除上述三型贴附型细胞外， 还有一些组织和细胞，如神经还有一些组织和细胞，如神经 组织的细胞等，难以确定它们组织的细胞等，难以确定它们 规律的形态，可统归入多形型规律的形态，可统归入多形型 细胞。细胞。 2 2、悬浮型、悬浮型 有的细胞在培养时不贴附于有的细胞在培养时不贴附于 支持物上，而呈悬浮状态生长支持物上，而呈悬浮状态生长 ，如某些癌细胞和血液白细胞，如某些癌细胞和血液白细胞 可呈悬浮型。可呈悬浮型。 细胞悬浮生长时，胞体为圆形，观察时细胞悬浮生长时，胞体为圆形，观察时 不如贴附型方便。但优点是细胞悬浮在培不如贴附型方便。但优点是细胞悬浮在培 养液中生长，生存空间大，允许长时间生养液中生长，生存空间大，允许长时间生 长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢等长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢等 研究。研究。 二、培养细胞的生长和二、培养细胞的生长和 增殖过程增殖过程 细胞在体外培养后，在一切条件细胞在体外培养后，在一切条件 适宜的情况下，最主要的活动是生长适宜的情况下，最主要的活动是生长 和增殖。和增殖。 细胞生长：细胞生长：细胞体积增大。细胞体积增大。 细胞增殖细胞增殖：细胞数量增多。细胞数量增多。 1 1、培养细胞的生命周期、培养细胞的生命周期 组织培养细胞生命周期指细胞组织培养细胞生命周期指细胞 在培养中持续增殖和生长的时间。在培养中持续增殖和生长的时间。 体内组织细胞的生存期与完整机体体内组织细胞的生存期与完整机体 的死亡衰老基本相一致的死亡衰老基本相一致。 进行正常细胞培养时，不论细胞进行正常细胞培养时，不论细胞 的种类和供体的年龄如何，在细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞 全生存过程中，大致都经历以下三全生存过程中，大致都经历以下三 个阶段：个阶段： vv原代培养期原代培养期 vv 传代期传代期 vv 衰退期衰退期 2 2、培养细胞的一代生存期、培养细胞的一代生存期 细胞细胞“ “一代一代” ” 仅指从细胞接种到分仅指从细胞接种到分 离再培养时的一段时间，如某一细离再培养时的一段时间，如某一细 胞系为第胞系为第153153代细胞，即指该细胞系代细胞，即指该细胞系 已传代已传代153153次。它与细胞世代或倍增次。它与细胞世代或倍增 一代不同；一代不同；细胞世代细胞世代是指细胞的生是指细胞的生 命周期。而在细胞的一代中，细胞命周期。而在细胞的一代中，细胞 能倍增能倍增5 56 6次。次。 细胞传一代，一般要经过以下细胞传一代，一般要经过以下 三个阶段：三个阶段： vv 潜伏期潜伏期 vv 指数增长期指数增长期 vv 停滞期停滞期 培养细胞的生长曲线 3 3、细胞周期、细胞周期 一个细胞周期是从一次细胞分裂结一个细胞周期是从一次细胞分裂结 束开始，经过物质积累过程，直到下束开始，经过物质积累过程，直到下 一次细胞分裂结束为止，这种细胞物一次细胞分裂结束为止，这种细胞物 质积累和细胞分裂的循环过程，称为质积累和细胞分裂的循环过程，称为 细胞周期细胞周期。 细胞周期分为细胞间期和细胞分裂细胞周期分为细胞间期和细胞分裂 期两个阶段。期两个阶段。 4. 4. 细胞系的生长过程细胞系的生长过程 细胞系在培养中能够存活时间的长细胞系在培养中能够存活时间的长 短，主要取决于细胞来自何种动物种短，主要取决于细胞来自何种动物种 族及年龄。不同的细胞体外培养可传族及年龄。不同的细胞体外培养可传 代数不同，当细胞发生遗传性改变，代数不同，当细胞发生遗传性改变， 如获永生性或恶习性转化时，细胞的如获永生性或恶习性转化时，细胞的 生存期可能发生改变。生存期可能发生改变。 人胚二倍体成纤维细胞培养，人胚二倍体成纤维细胞培养， 在不冻存和反复传代条件下，可在不冻存和反复传代条件下，可 传传30305050代，相当于代，相当于150150300300个个 细胞增殖周期，能维持细胞增殖周期，能维持1 1年左右的年左右的 生存时间。生存时间。 恒河猴的皮肤成纤维细胞能传 40代；鸡胚胎成纤维细胞最多能 传30代；小鼠成纤维细胞只能传8 代左右；如供体为成体或衰老个 体，则生存时间更短；如培养的 肝细胞或肾细胞，仅能传几代或 几十代。 体外培养条件可能延迟细胞 衰老，寿命从50代延至150代 。当细胞发生遗传性改变，如 获永生性或恶习性转化时，细 胞的生存期可能发生改变。 第三章第三章 培养细胞性状的检测与保存培养细胞性状的检测与保存 细胞在体外培养过程中需要每天细胞在体外培养过程中需要每天 进行常规检查和显微镜观察，及时进行常规检查和显微镜观察，及时 了解细胞生长状态、数量改变、细了解细胞生长状态、数量改变、细 胞形态、细胞有无移动、有无污染胞形态、细胞有无移动、有无污染 、培养液的、培养液的pHpH是否变酸、变黄是否是否变酸、变黄是否 需要更换等。需要更换等。 一、细胞常规检查观察的内容一、细胞常规检查观察的内容 1 1、肉眼观察、肉眼观察 2 2、显微镜观察、显微镜观察 3 3、离体活细胞染色观察、离体活细胞染色观察 (1)(1)中性红染色中性红染色 (2)(2)结晶紫染色结晶紫染色 (3)(3)台盼蓝染色台盼蓝染色 4 4、固定细胞观察法、固定细胞观察法 组织培养既可直接观察活细胞，也 可进行固定制成永久标本观察。标本 制好以后可以长期保存和做长时间的 观察、分析。 5、固定细胞染色观察法 培养细胞染色有培养细胞染色有一般一般和和特殊特殊之分；一般染色为之分；一般染色为 观察细胞一般形态之用，特殊染色为用于观察细观察细胞一般形态之用，特殊染色为用于观察细 胞特殊成分的染色方法。胞特殊成分的染色方法。 常用染色法：常用染色法： (1)Giemsa(1)Giemsa染色法染色法 (2)(2)苏木精苏木精- -伊红（伊红（H.E.H.E.）染色法）染色法 (3)Feulgen(3)Feulgen染色法染色法 (DNA(DNA特异性染色特异性染色) ) (4)(4)吖啶橙染色荧光观察法吖啶橙染色荧光观察法 二、细胞增殖生长二、细胞增殖生长 细胞增殖生长率是判定细胞活力的重要细胞增殖生长率是判定细胞活力的重要 指标，有多种显示方法。指标，有多种显示方法。 常用方法：常用方法： 1.1.细胞计数细胞计数 2.2.生长周期的检测生长周期的检测 3.3.细胞周期测定细胞周期测定 4.4.生长晕的测量生长晕的测量 1.细胞计数 用细胞计数法测定细胞生长动力学是目 前采用的最普遍的方法。 计数方法： 血细胞计数板人工计数 细胞计数器 计数平均值计数平均值1010 4 4 稀释倍数稀释倍数 = =细胞数细胞数/ml/ml 计数中，如果细胞悬液的细胞浓度过计数中，如果细胞悬液的细胞浓度过 高，必须稀释后再计；如果细胞数太少高，必须稀释后再计；如果细胞数太少 ，可离心浓缩后再计。每个细胞悬液至，可离心浓缩后再计。每个细胞悬液至 少滴样两次求平均值。少滴样两次求平均值。 2.2.生长周期、细胞周期的检测生长周期、细胞周期的检测 任何一个细胞系在接种培养过程中均任何一个细胞系在接种培养过程中均 经过生长缓慢期、快速生长和最后维经过生长缓慢期、快速生长和最后维 持稳定期的生长周期。掌握一个细胞持稳定期的生长周期。掌握一个细胞 系的生长周期，必须严格控制取样、系的生长周期，必须严格控制取样、 培养时间等培养条件。培养时间等培养条件。 细胞周期 有丝分裂 细胞系生长周期曲线 DT：倍增时间（doubling time） 3、流式细胞仪检测细胞周期时相和DNA 合成 近年来流式细胞仪的发展已成为检测 细胞增殖周期的主要手段，可进行多项 检测，如细胞周期时相、DNA合成强 度、持续时间等，已取代了应用同位素 等繁琐方法。特别是培养细胞非常适用 于做流式细胞仪检测的对象，且程序简 单、快速、效果准确。 4.4.生长晕的测量生长晕的测量 外植块外周形成薄而透明的生长晕时外植块外周形成薄而透明的生长晕时 ，表明培养物生长正常；取生长良好，表明培养物生长正常；取生长良好 的培养物观察其生长情况。从起始培的培养物观察其生长情况。从起始培 养后间隔一定时间，如培养养后间隔一定时间，如培养2424小时和小时和 4848小时，在显微镜下借用投影描画仪小时，在显微镜下借用投影描画仪 将组织块大小和生长晕外周轮廓画在将组织块大小和生长晕外周轮廓画在 同一张纸上。同一张纸上。 成纤维母细胞生长晕绘图 中央E为接种培养 的外植块面积；A为 培养6小时时的生长 晕面积；B为培养12 小时后的生长晕面积 ；C为培养24小时时 的生长晕面积。 三、细胞培养的污染及控制三、细胞培养的污染及控制 污染是细胞培养的大敌。预防和污染是细胞培养的大敌。预防和 避免污染是细胞培养成功的关键避免污染是细胞培养成功的关键 之一。之一。 ( (一一) ) 细胞微生物污染的类型细胞微生物污染的类型 1.1. 细菌污染细菌污染 2. 2. 真菌污染真菌污染 3. 3. 支原体污染支原体污染 4. 4. 病毒污染病毒污染 5. 5. 非同种细胞污染非同种细胞污染 （二）（二） 污染来源及鉴别污染来源及鉴别 1.1. 污染来源污染来源 （1 1）不洁的动物组织标本）不洁的动物组织标本 （2 2）空气）空气 （3 3）清洗消毒）清洗消毒 （4 4）操作）操作 2. 2. 污染的鉴别污染的鉴别 （1 1）细菌、真菌污染的检测）细菌、真菌污染的检测 （2 2）支原体污染的检测）支原体污染的检测 （三）三） 污染的清除和预防污染的清除和预防 1.1. 污染的清除污染的清除 （1 1）使用抗生素）使用抗生素 （2 2）加温处理）加温处理 2. 2. 污染的预防污染的预防 （1 1）从物品、用品消毒灭菌着手）从物品、用品消毒灭菌着手 （2 2）从操作者做起）从操作者做起 （3 3）防止细胞交叉污染）防止细胞交叉污染 四、细胞的冻存与复苏技术四、细胞的冻存与复苏技术 一、细胞的冻存 细胞在不加任何保护剂的情况 下直接冷冻，细胞内外的水分会很 快形成冰晶，从而导致细胞死亡。 采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)作保 护剂，这两种物质分子量小，溶解 度大，易穿透细胞，可以使冰点下 降，提高细胞膜对水的通透性，且 对细胞无明显毒性。 慢速冷冻方法又可使细胞