核酸分子杂交技术101108ppt课件

严永敏严永敏 细胞与分子诊断系细胞与分子诊断系 1 目目 录录 基本原理基本原理 核酸探针核酸探针 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 2 3 分子杂交 当两条不同来源的单链核酸分子DNA-RNA或 DNA-DNA链之间存在互补的碱基序列时，通过碱 基互补配对形成双链杂交体的过程，称为分子杂 交（molecular hybridization） 。 分子杂交图 4 概念：用同位素或其他化学方法标记的与待测靶核 苷酸序列互补杂交的核酸片段（DNA/RNA ） 。 用途：检测待检核酸样品中的特定基因序列。 (DNA-DNA; DNA-RNA; RNA-RNA) 第二节 核酸探针 5 2随机引物法 (random priming) 人工合成68bp不同排列顺序核苷酸片段引物， 在Klenow片段作用下，合成与探针DNA互补的 DNA链，当在反应液中加入一种被标记dNTP时， 即可形成标记的DNA探针，但探针DNA序列是长 短不等的。 优点：比活度高，结果稳定 8 随机引物标记法示意图 9 3DNA探针的末端标记 Klenow大片段的末端标记法 10 DNA半抗原标记探针的检测 显色系统： 碱性磷酸酶 NBT-紫色 辣根过氧化物酶 DAB-红色 底物 4. 探针的检测 11 第三节 核酸分子杂交技术 杂交类型 检测目的及范围 Southern印迹杂交 检测经 凝胶电泳分离且转移至膜上的 DNA分子 Northern印迹杂交 检测经 凝胶电泳分离且转移至膜上的 RNA分子 菌落杂交 检测固定在膜上，经裂解从细菌体释 放的DNA分子 斑点杂交 检测固定在膜上的DNA或RNA分子 原位杂交 检测细 胞或组织中的DNA或RNA分子 12 -DNA检测 将混合DNA样品经凝胶电泳分离，被分离的DNA 片段从凝胶转移到膜上，经标记的探针杂交，从而 检测特定DNA片段。 一、Southern印迹杂交 13 Paper Towels tissue SDSProtKPhenol Chloro ETOH Spin 14 Northern印迹杂交流程图 二、Northern印迹杂交 15 -1，4糖基转 移酶在损伤坐 骨神经中的表 达 16 三、基因表达产物的检测 Western印迹法 蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹， 即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经放即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经放 射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表 达量。达量。 优点优点: : 分辨率高分辨率高(15ng);(15ng);特异特异; ;简便简便; ;稳定稳定 17 18 原位杂交 原位杂交(in situ hybridization, ISH): 利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针，通 过射自显影或非放射检测系统在组织、细胞及染 色体上检测特异DNA或RNA序列的一种技术。 19 基本步骤: 20 What is FISH? Fluorescence In Situ Hybridization (荧光原位杂交) 21 一、FISH:一种利用荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术 22 *荧光原位杂交的特点： 1）快速；2）信号强；3）特异性高；4）多色； 5）可以检测复杂的染色体异常：转位、缺失、微小缺失。 *FISH有上述优点的原因： 使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统 23 基本原理 24 二、FISH检测标本 细胞-中期染色体、间期核 25 三、用于FISH的探针种类 单一序列探针重复序列探针全染色体涂抹探针 着丝粒 端粒 26 用于FISH的探针 1）单一序列探针：基因座特异探针 来源：Cosmid，Plasmid， cDNA片段 应用 （a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断。 27 DNA片段的染色体定位 28 21q22.2 在Down综合征间期细胞中的杂交信号 29 ）简单重复序列探针(simple repetitive probes) 其靶序列为卫星DNA或卫星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色体的着丝粒，重 复数百次至数千次。 特点：信号强 应用：(a)标记染色体识别(着丝粒探针） (b)染色体数目异常检测 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊断 包括：着丝粒探针、端粒重复探针 30 端粒重复探针用于检测数目异常（非染色体特异） 31 着丝粒探针用于检测非整倍体（染色体特异） Klinefelter综合征（发育迟缓） 32 ）染色体涂染探针(chromosome painting probes) 整条染色体探针或染色体区带特异性探针，来源于一条染 色体DNA文库，识别一条特定染色体全长的单一序列。 检测中期细胞染色体。 应用：（1）染色体数目和结构异常分析； （2）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。 33 34 FISH技术的应用 1）基因（或DNA片段）的染色体定位； 2）遗传性疾病：染色体数目与结构异常检测； 3）间期细胞遗传学（绒毛/羊水/精子/卵裂球/其 它间期细胞研究与诊断）； 4）肿瘤遗传学研究:原癌基因检测