基因信息的传递

第三篇 基因信息的传递 遗传信息传递的中心法则 DNA 复制 RNA 转录 蛋白质 翻译 RNA 逆转录 复制 蛋白质 翻译 * DNA通过基因表达，决定了蛋白质的结构 、功能 * DNA通过复制，将基因信息代代相传 * RNA参与DNA遗传信息的表达 * RNA也可作为某些病毒遗传信息的载体 本 篇 主 要 内 容 1、复制（replication） 2、基因表达 转录（transcription） 翻译（translation） 3、基因表达调控 4、基因工程（genetic engineering ) （gene expression) （control of gene expression) 第十章 DNA的生物合成 复制 (replication) 由亲代DNA合成两个相同的子代 DNA的过程。 复制 亲代DNA 子代DNA 子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式 半保留式 混合式 一、半保留复制 （一）半保留复制的定义 复制时，母链的双链DNA解开成两股单链，各 自作为模板指导子代合成新的互补链。子代细 胞的DNA双链，其中一股单链从亲代完整地接 受过来，另一股单链则完全重新合成。由于碱 基互补，两个子细胞的DNA双链，都和亲代母 链DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保 留复制（semi-conservative replication)。 A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C C C A C T G G G G T G A C C A G G T A C T G T C C A T G A C T C C A T G A C A G G T A C T G A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C + 母链DNA 复制过程中形成 的复制叉 子代DNA （二）半保留复制的实验依据 （三）半保留复制的意义 1、使亲代DNA所含的信息以极高的准确度传 递给子代DNA分子。 2、DNA通过复制和基因表达这两种主要功能 ，决定了生物的特性和类型并体现了遗传过程 的相对保守性。 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但 不是绝对的。 二、双向复制 （一）双向复制的定义 复制时，DNA从起始点（origin）向两个 方向解链，形成两个延伸方向相反的复 制叉，称为双向复制（bidirectional replication） 。 复制中的放射自显影图象 （二）原核生物的双向复制 ori ter A B C A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter) （三）真核生物的双向复制 真核生物每个染色体有多个起始点，是多 复制子的复制。 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为 一个复制子(replicon) 。复制子是独立完 成复制的功能单位。 5 3 oriorioriori 5 3 5 5 3 3 5 5 3 复制子 3 三、复制的半不连续性 DNA双螺旋的两条链是反平行的，而DNA合成的 方向只能是53 。 在DNA复制时，1条链的合成方向和复制叉的前 进方向相同，可以连续复制，叫作前导链（ leading strand）；而另一条链的合成方向和复制 叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只能分 成几个片段（冈崎片段）合成，称之为滞后链（ lagging strand）。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制 的半不连续复制。 3 5 3 5 解链方向 3 5 3 3 5 领头链 (leading strand) 随从链 (lagging strand) 半不连续复制 四、复制的高保真性 DNA复制的精确度极高，误差率很低，以保证物 种在维持遗传保守性的同时，还要通过变异不断 进化。 DNA复制的高度忠实性至少要依赖三种机制： 1、遵守严格的碱基配对规律； 2、DNA聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能 ； 3、复制出错时，DNA聚合酶的即时校读功能。 复制的保真性和碱基选择 DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键 ）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相 应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型 。 DNA聚合酶的即时校读功能 第二节 DNA复制的酶学 一、复制的化学反应 （一）复制的反应体系 1底物：四种 dNTP：dATP 、dTTP、 dGTP、 dCTP 2聚合酶：依赖DNA的DNA聚合酶，DNA- pol； 3模板：指解开成单链的DNA母链； 4引物：提供3OH末端，使dNP可以依 次聚合； 5其他酶和蛋白质因子。 （二）复制的化学反应 在聚合酶的作用下，一个核苷酸 5-P和相 邻的核苷酸上核糖的3 -OH生成磷酸二酯 键而逐一聚合的形成多核苷酸链。 （dNMP）ndNTP（dNMP）n+l ppi DNA链生成过程，DNA 新链生成需引物 和模板； 只能从5-端向3-端延长。 复制的化学反应 (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 二、参与复制的主要酶类 （一）DNA聚合酶 （二）解链解旋酶 （三）引物酶 （四）DNA连接酶 （一）DNA聚合酶 全称：依赖DNA的DNA聚合酶（DDDP ）缩写：DNApol 活性： 1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | | 3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5外切酶活性 5 3外切酶活性 ? 能切除RNA引物和突变的 DNA片段 。 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 核酸外切酶活性 1原核生物的DNA聚合酶 DNA-pol I DNA-pol II DNA-pol （1）DNA聚合酶： 结构特点 单一多肽链，从N端到C端有3个酶促活 性结构域依次排列：53外切酶、 35外切酶和DNA聚合酶。 DNA Pol I在蛋白酶的作用下，可分为大 、小两个片段。小片段具有53外 切酶活性。大片段（又称为Klenow片段 ）具有聚合酶活性及35 外切酶活性 ，它对核酸技术十分有用。 DNA-pol （109kD） 323个氨基酸 小片段 5 核酸外切 酶活性 大片段/Klenow 片段 604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 N 端C 端 木瓜蛋白酶 DNA-pol Klenow片段是实验室合成DNA，进行 分子生物学研究中常用的工具酶。 DNA-pol I在活细胞内的功能 1）53聚合酶的活性：对复制和修复 中出现的空隙进行填补。 2）35外切酶活性：对复制中错误进 行即时校读，保证复制的准确性。 3）53外切酶活性：可去除RNA引物 和突变碱基。 （2）DNA-pol II 53聚合酶活性 35外切酶活性 无53外切酶活性 它只是在无pol I及pol 的情况下才起作 用，其真正的功能也未完全清楚，可能 在损伤修复中有特殊作用。 （3）DNA pol- 结构特点 由10种亚基（ ）组成不 对称异源二聚体。 核心酶（） 亚基：53 聚合酶活性 亚基：3 5外切酶活性和碱基选择功能， 是复制保真性所必需 亚基:可能起组装作用 亚基：夹稳模板链并使酶沿模板链滑动 复合物：促进全酶组装至模板及增强核心 酶活性 DNA-pol (250kD) DNA-pol 在活细胞内的功能 53聚合酶的活性： 是在复制延长中真正催化新链核苷酸聚 合的酶。 35外切酶活性：对复制中错误进行即 时校读，保证复制的准确性。 催化DNA 聚合 参与DNA损 伤的应急状态 修复 修复合成、 切除引物、 填补空隙 功能 2040400分子数/细胞 1011亚基数 +5 外切酶活性 + 5外切酶活性 +5 聚合酶活性 pol IIIpol IIpol I E. Coli中的DNA聚合酶 2真核生物的DNA聚合酶 DNApol ，。 DNApo1：延长领头链和随从链； DNApoI：合成RNA引物； DNApol：校读、修复和填补缺口。 DNApol：在没有其他DNApol时 发挥催化功能。 DNApo1：催化线粒体DNA的合成。 真核生物的DNA聚合酶 真核生物的DNA聚合酶 （二）与复制起始及解链解旋相关的酶类 在复制起始时需要多种酶和蛋白因子， 共同起解开、理顺DNA链，维持DNA在 一段时间内处于单链状态的作用。 E. Coli 基因图 1. 与复制起始及解链相关的酶类及蛋白 （1） DnaA蛋白 （2） DnaB蛋白（解螺旋酶） （3） DnaC蛋白 （1）DnaA蛋白 DnaA蛋白是由相同亚基组成的四聚体。 复制起始时， DnaA蛋白辨认并结合 E.coli上复制起始点oriC，1020个DnaA 蛋白相互靠近形成DNA蛋白质复合体结 构，促使oriC局部解链。 复制起始点（E.coli-oriC） GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATTACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA 58 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列反向重复序列 5 3 5 3 识别区AT富含区 （2）DnaB蛋白 解螺旋酶、复制蛋白rep ，利用ATP供能 ，作用于氢键，使DNA双链解开成为两 条单链。 Dna B Dna C 解链方向 （3） DnaC蛋白 Dna C蛋白的作用是将具有解链酶活性的 Dna B蛋白运送到复制模板，并协同Dna B 蛋白的作用。 DnaB、DnaC DnaG（引物酶 ） DnaA蛋白复合物 解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、 缠绕、连环等现象。 2DNA拓扑异构酶 （DNA topoisomerase） DNA拓扑异构酶，改变DNA分子构象， 理顺DNA链，使复制能顺利进行。 分类：拓扑酶和拓扑酶 作用特点：对DNA分子的作用是既能水 解，又能连接磷酸二酯键。 DNA分子一边解链，一边复制，拓扑酶 是在复制全过程中都是有作用的。 拓扑异 构酶 切断DNA双链中一股链，使DNA 解链旋转不致打结；适当时候封 闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。 拓扑异 构酶 切断DNA分子两股链，断端通过 切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA 分子进入负超螺旋状态。 作用机制 目 录 3单链DNA结合蛋白 单链DNA结合蛋白（single stranded DNA binding protein，SSB） 的作用是在复制中维 持模板处于单链状态并保护单链的完整。 模板的DNA总要处于单链状态，而DNA分子只 要符合碱墓配对，又总会有形成双链的倾向， 以使分子达到稳定状态和免受胞内广泛存在的 核酸酶降解。 （三）引物酶 DNA聚合酶不能从头合成DNA链，只能延长已 有的DNA或RNA引物链。 引物酶（primase）在复制起始时催化引物（ primer）合成，提供3-OH末端，使DNA-pol能 够催化dNTP聚合。 引物酶属DNA指导的RNA 聚合酶，但不同于 催化转录过程的RNA聚合酶。在E.coli，引物 酶是dnaG基因的产物DnaG。 （四）DNA连接酶 （DNA ligase） 连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链的5 P 末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相 邻的DNA链连成完整的链。 特点：连接酶连接碱基互补基础上的双链中的 单链缺口，它并没有连接单独存在的DNA单链 或RNA单链的作用。 功能：在复制中起最后接合缺口的作用，在 DNA修复、重组、剪接中也起缝合缺口作用， 也是基因工程的重要工具酶之一。 HO5 3 3 5 DNA连接酶 ATP ADP 53 53 三种酶催化生成磷酸二酯键的比较 第三节 DNA生物合成过程 一、原核生物DNA生物合成 （一）复制的起始 （二）复制的延长 （三）复制的终止 1、DNA解链 2、引发体的形成并合成引物 3、超螺旋的转型 （一）复制的起始 DnaA蛋白辨认起始点, 形成起始复合物 DnaB蛋白解螺旋 DnaC蛋白协助DnaB 在多种蛋白质参与下， DNA解开成单链 HU蛋白促进起始 SSB维持单链稳定 Dna A Dna B、 Dna C DNA拓扑异构酶 引物 酶 SSB 3 5 3 5 引发体的形成 含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。 引物的合成 Dna A Dna B、 Dna C DNA拓扑异构酶 引物酶 OH SSB 3 5 3 5 引物酶 OH 引发体的蛋白质部分在DNA链上可以移动 ，并需由ATP供给能量。引发体到达适当 位置就可按照模板的配对序列，催化NTP （不是dNTP）的聚合，生成引物。 DNA复制是半不连续，一股链是可以连续 进行的，另一股链是不连续复制的，在不 连续复制的链上，引发体需多次生成。 引发体的生成和DNA解成复制叉 （三）超螺旋的转型 解链将导致下游发生打结现象或DNA超螺 旋的其他部分过度拧转。 拓扑酶通过切断、旋转和再连结的作用， 实现DNA超螺旋的转型，即把正超螺旋变 为负螺旋。 实验证明，负超螺旋比正超螺旋有更好的 模板作用。 + 复制起始的过程 1DnaA蛋白辨认结合oriC的重复序列，并与 DNA形成复合物，引起解链； 2DnaB在DnaC的辅助下结合于初步打开的双 链，并用其解螺旋酶活性开链； 3拓扑酶通过切断、旋转和再连结的作用，实 现DNA超螺旋的转型； 4SSB结合在已开链的DNA模板上，使DNA在 一定的范围内保持开链状态。 5引物酶介入，形成的引发体，可按照模板的 配对序列，催化NTP的聚合，生成引物。 （二）复制的延长 脱氧单核苷酸逐个加入而延长DNA新链， 其化学反应本质是生成磷酸二酯键。 催化此反应的酶： 原核生物：DNA-pol 真核生物：DNA-pol催化不连续复制 DNA-pol催化连续复制 （）复制延长的生化过程 复制起始时，母链即已解开，两股单链 都是模板，其作用是按碱基配对规律指 引核苷酸加入到新链。 每次加入的单个核苷酸，都是以dNTP为 原料，复制时子链从5向3延长。 复制延长速度相当快。E.coli每秒钟能加 入的核苷酸数达2500个。 （二）复制的半不连续性和冈崎片段 在形成双螺旋结构时，DNA双链的走向是 相反的。 复制经解链后，两股单链在复制叉上也是 走向相反。 复制，包括引物合成，只能从5向3延伸 。而在同一复制叉上，解链的方向只可能 有一个。 复制方向与解链方向不一致 可以理解不连续复制的成因 1领头链连续复制 顺着解链方向而生成的子链，复制是连 续进行的，这股链称为领头链（leading strand)。 2随从链不连续复制 复制的方向与解链方向相反生成的子链 称为随从链（ lagging strand） 。 随从链的复制必须等待模板链解开至足 够长度，才能从53方向生成引物然后 复制。 随从链在延长时，又要等到下一段暴露 出足够长而度的模板，再次生成引物而 延长。这就是不连续复制。 随从链的合成 随从链 3冈崎片段 随从链不连续复制的片段称为冈崎片段 ，其大小在10002000个核苷酸。 每一个不连续复制的片段5-端都带有一 个RNA引物。 片段的复制完成后，RNA引物会被除去 而代之以DNA片段，因此复制至最后， 两股子链都是DNA链。 冈崎片段 3 5 3 5 解链方向 35 335 冈崎片段 在同一个复制叉上，领头链 的复制先于后随链，但两链 是在同一DNApol 催化下 进行。即随从链的模板可折 叠或环绕成环状，与前导链 正在延长的区域对齐，使领 头链和随从链的生长点都处 在DNApol 催化位点上。 解链方向就是酶的前进方向 ，也是复制叉延伸方向。 复 制 延 长 简 图 （三）复制的终止 原核生物基因是环状DNA，双向复制的 复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。 复制的起始点和终止点刚好把环状DNA 分为两个半圆，两个方向各进行180，同 时在终止点汇合。 为了定位方便，习惯把E.coli的DNA分为 100等分。E.coli复制起始点oriC在82位点 ，复制终点ter（termination）在32位点 。 Ecoli 基因图 ori ter E.coli 82 32 ter oriC 5 5 DNA-pol 5 OHP 5 DNA-pol dNTP 5 5P 5 5 ATP ADP+Pi DNA连接酶 随从链上不连续性片段的连接 哺乳动物的细胞周期 DNA合成 (synthesis) 期 G1 G2 S M 人 为 分 成 起始、延长、终止三个阶段 二、真核生物的DNA生物合成 （一）复制的起始 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子 复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活 而不是同步起动。 复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和 pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制 因子(replication factor, RF)。 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用 。 3 5 5 3 领头链 3 5 3 5 亲代DNA 随从链 引物 核小体 （二）复制的延长 （三）复制的终止 染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连 接。 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA 引物，去除后留下空隙。 5 3 3 5 5 3 3 5 + 5 3 3 3 3 5 5 5 端粒(telomere) 指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。 功能 维持染色体的稳定性 维持DNA复制的完整性 结构特点 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基 的短 序列。 TTTTGGGGTTTTGGGG 端粒酶(telomerase)的组成 端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 端粒酶的催 化延长作用 爬 行 模 型 DNA聚合酶复制子链 进一步加工 端粒和端粒酶的生物学意义 端粒特别是端粒酶的活性与细胞的生长、繁 殖、衰老凋亡以及肿瘤的发生密切相关。 端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及年 龄的增长而逐渐变短至消失，可导致染色体 稳定性下降，导致细胞衰老凋亡。 体细胞几乎没有端粒酶活性，随多次细胞分 裂端粒逐渐缩短，细胞失去增殖能力。而端 粒酶活性较高的胚原细胞，端粒长度未缩短 。 肿瘤细胞端粒酶重新获得活性，以维持端粒 结构致使染色体稳定而成为永生细胞。 肿瘤细胞的端粒比正常人同类细胞显著缩短 。 逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways 第四节 逆转录酶(reverse transcriptase) 逆转录 逆转录酶 一、逆转录病毒和逆转录酶 （一）逆转录 在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成 DNA的过程。此过程中，核酸合成与转 录（DNARNA）过程遗传信息的流 动方向相反（RNADNA），故称为 逆转录（reverse transcription) 。 （二）逆转录病毒 RNA病毒的基因组是RNA而不是DNA，其复制 方式是逆转录，故称为逆转录病毒（retrovirus ）。 RNA病毒感染活细胞后，要先经逆转录成为双 链DNA，通过基因重组方式，参加入宿主细胞 基因组，并随宿主细胞复制和表达。这种重组 方式称为整合（integration）。 病毒基因的整合可能是病毒致癌的重要方式。 （三）逆转录酶 能催化以单链RNA为模板合成双链DNA的反应 的酶称为逆转录酶（reverse transcriptase)。 它兼有三种酶的活性：RNA指导的DNA聚合酶 ，DNA指导的DNA聚合酶和RNase H活性。 所谓RNase H活性是指除去杂合分子中的RNA。 它可以从53和35两个方向水解DNA RNA。 逆转录酶和其他DNA聚合酶一样，合成DNA的 方向为53，并且不能从头合成DNA，也需 要引物，是病毒本身的一种tRNA。 二、逆转录过程 1以单链RNA的基因组为模板，在逆转录酶 (RNA指导的DNA聚合酶)的催化下，合成一条单 链DNA； 2产物与模板生成RNADNA杂化双链，杂化双 链中的RNA被逆转录酶(RNase H)水解； 3以新合成的单链DNA为模板，逆转录酶(DNA 指导的DNA聚合酶)催化合成第二链的DNA。 逆转录病毒细胞内的逆转录现象 RNA 模板 逆转录酶 DNA-RNA 杂化双链 RNA酶 单链DNA 逆转录酶 双链DNA 逆转录酶 A AA A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 碱水解 T T T T 分子生物学研究可应 用逆转录酶，作为获取基 因工程目的基因的重要方 法之一，此法称为cDNA法 。 以mRNA为模板，经逆转 录合成的与mRNA碱基序列互 补的DNA链。 试管内合成cDNA 三、逆转录酶和逆转录现象的生物学意义 （一）逆转录酶和逆转录现象是分子生物 学研究中的重大发现 RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能 。 （二）对逆转录病毒的研究，拓宽了病毒 致癌理论。 （三）分子生物学研究应用逆转录酶（ cDNA法)，作为获取基因工程目的基因的 重要方法之一。 第五节 DNA损伤（突变）与修复 DNA Damage (Mutation) and Repair 一、突变的定义 二、突变的意义 三、引发突变的因素 四、突变的分子改变类型 五、DNA损伤的修复 一、突变的定义： 个别脱氧核糖核苷酸残基甚至片段DNA在 构成、复制或表型功能上的异常变化，称 为突变（ Mutation），也称为DNA损伤（ DNA damage）。 遗传物质结构改变引起遗传信息的改变。 二、突变的意义 （）突变是进化、分化的分子基础 自发突变或自然突变 （二）突变导致基因型改变 多态性：个体之间的基因型差别。 （三）突变导致死亡 突变发生在对生命过程至关重要的基因上，可 导致个体、细胞的死亡。 （四）突变是某些疾病的发病基础 有害的突变 三、引发突变的因素 （一）自发突变 （二）诱发突变 1物理因素：主要指紫外线和各种辐射， 如紫外线可引起DNA链上相邻的两个嘧啶 碱基发生共价结合，生成嘧啶二聚体。 2化学因素：化工原料、化工产品和副产 品，各种工业的排放物、农药、食品防腐 剂或添加剂，以至汽车排放的废气。 嘧啶二聚体的形成与解聚 四、突变分子改变的类型 错配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入 (insertion) 重排 (rearrangement) 框移 (frame-shift) （一）错配（mismatch） DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。点突变发生在基因的编码区域，可 导致氨基酸的改变。 1. 转换：发生在同型碱基之间，即嘌呤代替 另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 2. 颠换：发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧 啶或嘧啶变嘌呤。 镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基 N-val his leu thr pro val glu C 肽链 CAC GTG 基因 正常成人Hb (HbA)亚基 N-val his leu thr pro glu glu C 肽链 CTC GAG 基因 膀胱癌细胞c-rasH基因点突变 （二）缺失、插入和框移突变 缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA 大分子上消失。 插入：原来没有的一个碱基或一段核苷 酸链插入到DNA大分子中间。 框移突变：三联体密码的阅读方式改变 ，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变 ，其后果是翻译出的蛋白质可能完全不 同。 谷 酪 蛋 丝 5 G C A G U A C A