基因组编辑技术ppt课件

基因组编辑 应用基因编辑技术不长角的奶牛 基因编辑的定义： 通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列，利用核 酸内切酶对DNA靶点序列进行切割，从而完成对靶细胞 DNA目的基因片段的精确编辑。 基因编辑的优势 与传统的以同源重组和胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)技术为基础的基因打靶技术相比 ，基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点，可 应用到更多的物种上，效率更高，构建时间更短 ，成本更低。 基因编辑原理 现代基因组编辑技术的基本原理是相同的，即 借助特异性 DNA 双链断裂( DNA double- strand breaks DSBs) 激活细胞天然的修复机 制，包括非同源末端连接( NHEJ)和同源重组 修复(HDR) 两条途径。 第一代: ZFN(锌指核酸酶) 第二代: TALEN(转录激活样效应因子核酸酶) 第三代: CRISPR/Cas9(成簇的规律性间隔的短回文重 复序列) 第四代：NgAgo - gDNA 韩春雨 基因编辑发展史 ZFN 基因组编辑技术 ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基 于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。 1986年Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的 DNA 结 合区域发现了Cys2- His2锌指模块。 1996年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。 2005年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识别 24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应用。 ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基 因位点，具有较好的发展潜力。 缺点: (1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN，需要 投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性 ，但仍然存在不同程度的脱靶效应。 TALEN 基因组编辑技术 2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发 现一种转录激活样效应因子(TAL蛋白),它的核酸结合域的氨基 酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元 识别一个碱基，简单且特异性极好。随后，TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。它可设计性更 强，不受上下游序列影响，具备比ZFN 更广阔的应用潜力。 TALENs 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都是由 TALE array 与 Fok融合而成. 其中一个 TALEN 靶向正义链上靶 标位点, 另一个则靶向反义链上的靶标位点. 然后 Fok形 成二聚体, 在靶向序列中间的 spacer 处切割 DNA, 造成双 链 DNA 断裂, 随后细胞启动 DNA 损伤修复机制. 针对不同 的TALEN 骨架, 其最适宜的spacer长度不同, 其长度范围一 般为1220 bp. 实验结果表明, TALENs在靶向DNA时, 第一个碱基为 T 时其结合效果更佳。 通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异 性敲除或内源基因的表达调控。 目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南 芥及酵母等多类物种中得到成功应用。 CRISPR /Cas9 基因组编辑技术 CRISPR/Cas9系统的发现可以追溯到1987年，日本学者 首次在大肠杆菌(E. coli)基因组中发现一连串短的空间间隔 重复序列。随后，在其他细菌和古细菌中也发现了这一特殊 的序列。 2002年科学家才将其命名为成簇的规律间隔短回文重复 序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) ，现有测序结果显示40%的 细菌基因组中含有CRISPR位点。 2005年，科学家们发现CRISPR中的许多间隔序列来源于 质粒和病毒，CRISPR的基因座能够被转录，并且Cas基因编码 的蛋白具有核酸酶和解旋酶结构域，因此推测CRISPR/ Cas 是利用无义的RNAs标记外源核酸序列的防御系统。 2011年，才揭示了CRISPR/Cas系统的分子机制： 当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合 到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR转 录生成crRNA前体(pre-crRNA)，pre-crRNA经过加工形成 含有与外源基因匹配序列的 crRNA，该crRNA与病毒基因 组的同源序列识别后，介导Cas蛋白结合并切割，从而保 护自身免受入侵。 2013年，研究者报道了CRISPR/Cas9系统可高效地 编辑基因组。其中分别在人类细胞和小鼠细胞中成功对 部分基因实现了编辑。 CRISPR/Cas系统概述 CRISPR/ Cas系统广泛存在于细菌和古菌中，是它们 的一种适应性免疫系统，能够识别自身和外源入侵DNA片 段。CRISPR/ Cas系统有3种类型：型、型和型。 型和型CRISPR/Cas系统较为复杂，需要多个 Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而型CRISPR/Cas系 统只需要一个Cas9蛋白核酸酶来切割DNA双链,即为现在 广泛应用于遗传学基因编辑的CRISPR/Cas9系统。 Type系统中只有一种核酸酶Cas9核酸酶，在 该系统中Cas9蛋白与crRNA参与对抗外源噬菌体和质粒的 入侵。目前，Type系统在基因组编辑中应用的最为广 泛。 CRISPR-Cas主要由两部分组成： CRISPR/Cas的结构 CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌基 因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats) 组成, 重复序列的长度通常 2148 bp, 重复序列之间被 2672 bp 间隔序列 (spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行 识别。 识别 切割 Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链 DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进 行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需 要形成二聚体才能发挥作用。 CRISPR/Cas9系统由间隔重复CRISPR基因座转录出来的 pre-crRNA、多功能的Cas9核酸酶和tracrRNA组成，其中 tracrRNA促进pre-crRNA的成熟，以及形成具有切割活性 的crRNA-tracrRNA-Cas9三元复合体。 病毒或质粒入侵细菌后，其基因组DNA暴露于细菌 胞浆之中，经过同源重组，CRISPR重复序列转录、翻译出 的Cas复合物对外来DNA进行剪切，产生新的spacer序列。 如果产生的新spacer序列能够与CRISPR array内部的短重 复序列部分互补，将会通过某种未知的方式整合到细菌基 因组的CRISPR array 序列中，从而对该病毒或质粒产生 特异性免疫记忆。 CRISPR/Cas9系统的工作原理和机制 CRISPR/Cas9系统的工作原理和机制 当同类的病毒或者质粒再次入侵该细菌时 首先，tracrRNA与pre-crRNA的重复序列结合； 第二，内源RNase 切割pre-crRNA/ tracrRNAs复合体 ，切除5末端的间隔序列，形成成熟的crRNA，并与 tracrRNA形成被称为向导RNA (Single guide RNA, sgRNA) 的嵌合RNA分子； 第三，每一个成熟的sgRNA能够引导Cas9蛋白定位到双 链DNA的靶位点上并在原型间隔毗邻序列(Proto-spacer adjacent motif, PAM)的上游38 bp位置对结合的序列进 行切割(图2A)。 Cas9的特异性靶点 依赖于原型间隔序列3端PAM序列，不同的Cas9突变体在基因组中 拥有不同的PAM序列，来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9 识别一个5- NGG-3的PAM，而来源于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningi-tidis)的Cas9分别 识别5-NNAGAAW-3的PAM和5-NNNNGATT-3的PAM。 Cas9拥有两个核酸酶结构域 分别是蛋白中间的HNH结构域和蛋白氨基酸末端附近的RuvC-like结构 域，其中HNH切割与crRNA互补的链，切割位点位于PAM序列上游3 bp，RuvC -like切割非互补链，切割位点位于PAM序列上游38 bp，从而造成双链的 断裂。 Cas9的特异性靶点和两个核酸酶结构域 CRISPR/ Cas9产生的DSB能够激活细胞和生物体自身修复 机制，产生两种不同的修复途径NHEJ和HDR修复。NHEJ能够高 效地引入不同长度的插入或者缺失突变，导致转录阅读框编 码序列，转录激活相关的启动子和增强子的损坏；而HDR的修 复通常会引入特定位点的突变或者在外源供体DNA模板存在时 对靶位点进行可预测的插入。 1. PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的基本条件。如 果靶序列3端没有PAM序列，即使靶序列与sgRNA序列完全匹配， Cas9蛋白也不会切割该序列位点. 2. sgRNA与目标基因组相结合的20nt序列区决定着CRISPR/Cas系 统的靶向特异性。 CRISPR/Cas9系统的关键点 3. sgRNA的长度也与特异性密切相关。sgRNA的5端额外增 加两个鸟嘌呤核苷酸后能够显著提高CRISPR/Cas9系统的特异 性。 CRISPR/Cas9基因编辑系统的特异性决定于sgRNA上 的识别(20nt)。然而，在复杂的生物基因组中，sgRNA 的识别序列可能会与非靶点DNA发生局部匹配(Partial match)。 这种局部匹配，目前可归结为两类： (1)sgRNA与脱靶位点DNA序列长度相同，但存在碱基错配 。 (2) 脱靶位点DNA序列长度比sgRNA多或少几个碱基，通过 形成DNA凸起(DNA bulge)或RNA凸起(RNA bulge)来完成 其他碱基的正确配对。 CRISPR/Cas9系统的脱靶效应 CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段编辑中的应用 1. DNA片段靶向删除 2. DNA片段靶向反转 3. DNA片段靶向重复 4. DNA片段靶向插入 5. 染色体靶向易位 类别ZFNTALENCRISPR /Cas9NgAgo-gDNA 构成 ZF ArrayFok1TALEN ArrayFok1 Cas9sgRNANgAgo-gDNA 靶向元件 ZF Array蛋白 TALENArray蛋白sgRNA核糖核苷酸gDNA脱氧核糖核苷 酸 切割元件 Fok 蛋白Fok 蛋白Cas9蛋白Ago蛋白 优势 单位点编辑单位点编辑多位点编辑多位点编辑 靶向序列 18bp30bp23bp20bp 切割类型 双链断裂，单 列缺刻 双链断裂，单列缺 刻 双链断裂，单列缺刻双链断裂，单列缺刻 技术难度 困难较容易非常容易非常容易 商业价格 60000每位点10000每位点1000每位点？ 脱靶效应 较轻较轻较严重较轻？ 编辑技术对比 NgAgo-gDNA编辑 NgAgo-gDNA是格式嗜盐杆菌（Natronobactricum grogoryi) ACO蛋白（Argonauto）的简称，其本质是 一种核酸内切酶，NgAgo根据指导DNA的定位，可以有 效地对基因组目标区域进行编辑。 NgAgo-gDNA 概述 NgAgo 是格氏嗜盐碱 杆菌 （Natronobacteriumgregoryi）AGO 蛋白 （Argonaute） 的简称 ， 其本质是一种核酸内切酶 。 NgAgo 酶根据指导 DNA 的定位 ， 可以有效地对基因 组目标区域进行编辑 。 NgAgo-gDNA 与 Crispr-Cas9 特点比较 NgAgo-gDNA Crispr-CAS9 5-P-ssDNA 介导sgRNA 介导 ssDNA无特殊二级结构要求 ，除靶序列一致的碱基无 需其它碱基参与 sgRNA由tracrRNA和crRNA组 成，需求固定的二级结构 结合靶序列23-25bp结合靶序列19-21bp 无需PAM区需要PAM区 NgAgo蛋白 由887个氨基酸 组成 CAS9蛋白 由1368个氨基酸 组成 可在哺乳动物细胞水平进 行基因组编辑 可在哺乳动物细胞水平进 行基因组编辑 NgAgo-gDNA 的优势 1. 设计更加灵活 由于NgAgo-gDNA系统无PAM要求，5p ssDNA设计相较sgRNA更加灵活 2. 理论上精确性会比Crispr-CAS9 高 NgAgo-gDNA识别靶序列的长度会比Crispr- Cas9长约4个碱基，另外DNA-DNA duplex的 特异性比RNA-DNA duplex高,所以理论上精确 性会更加高。 3. 对向导序列-靶序列错配容忍度低 4. 脱靶率低 5.5. 针对富含GC的靶序列，NgAgo系统 比Cas9系统切割效率更高 基因功能研究 基因治疗 构建模式动物 改造和培育新品种 基因编辑新技术的用途 1. 基因功能研究 基因敲除是在活体动物上验证基因功能必不可少的逻 辑环节， 但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打 靶载体构建、 ES 细胞筛选、 嵌合体动物模型选育等 一系列步骤， 成功率受到多方面因素的限制。 基因编辑新技术则不然， 敲除基因高效快速， 是研 究基因功能的有力工具 ZFN 技术已在大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、拟南芥、 玉米、烟草 等模式生物或经济物种的细胞或胚胎中以 及包括诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)在内的人体外培养细胞系中成功地实现 了内源基因的定点突变，其中在果蝇、 斑马鱼、大鼠 等物种中还获得了可以稳定遗传的突变体。 2. 基因治疗 传统的基因治疗是将正常的基因片段引入细胞中替代有缺陷的基因 ， 但这种方法难以精准控制， 可能产生很大的毒副作用。基因编 辑新技术可以精确定位， 在靶位点进行修正或进行基因切除， 达 到基因治疗的目的。 Bacman 等人利用 TALEN 技术清除了来自于病人线粒体内的有病 DNA 。这是 TALEN 首次应用于线粒体基因的编辑，这项研究有望用于治 疗母系遗传的线粒体病。 Li 等人利用 ZFN 技术能在染色体上精确定位的优势， 通 过 “剪切” 和 “粘贴” 基因， 在实验小鼠体内实现了 血友病治疗， 避免了传统基因疗法带来的插入诱变风险， 首次取得了基因组编辑在基因疗法上的突破。 3. 构建模式动物 基因编辑新技术不受 ES 细胞的限制，效率高，速度快，且 定点编