2011微生物标本采集技术（临床环镜空气）课件

微生物标本采集技术微生物标本采集技术 - -临床微生物临床微生物 -环境微生物环境微生物 感染办 谢少清 临床微生物标本采集技术临床微生物标本采集技术 l正确的微生物标本采集和运送，是 准确的病原学诊断的前提 基本原则 1.及时采集微生物标本作病原学检查 2.在抗菌药物使用前采集标本 3.采样时严格执行无菌操作 4.采样后立即送检 5.棉拭子标本宜用运送培养基 7.标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂。 8.送检标本应注明来源和检验目的 9.混有正常菌群的标本，不可置肉汤培养 如何提高细菌阳性检出率 标本采集时机 标本采集方法 标本的质与量 标本的运送与保存 镜检筛选合格标本 高质量、多种分离培养基 培养环境 痰标本采集 关于咳痰标本 l在抗生素应用前采集痰标本; l标本采集后12h内必须立即进行实验室处理； l咳痰标本应用最早且广泛，但也是最受争议的标本 ; l采集标本过程中要有专业的医务人员指导; 病原体种类繁多而复杂 使下呼吸道感染病原诊断成为难题 细菌（包括放线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌） 真菌（包括肺孢子菌） 病毒 支原体、衣原体与立克次体 原虫 寄生虫 痰标本采集-自然咳痰标本 患者清晨起床后，用清水或冷开水反复漱口去除过量 的口腔细菌，有假牙者应取下假牙。 先轻咳，咳出口腔中的痰液弃去，在用力深咳，从气 管咳出呼吸道深部的痰，直接吐入清洁、无菌的容器中 。 无痰可用35NaCl 5ml雾吸约5min导痰； 也可用物理疗法、体位引流等法取痰； *Dr.HU Bijie10 几种下呼吸道直接采集的标本 l经气管穿刺吸引transtracheal aspiration,TTA l经胸壁针刺吸引transthoracic needle aspiration, TNA l经支气管镜采样 支气管肺泡灌洗bronchoalveolar lavage, BAL 经支气管镜直接吸引 防污染样本毛刷protective specimen brush, PSB l开胸肺活检open-lung biopsy，OLB l经人工气道吸引分泌物 endotracheal aspirates，ETA 痰标本采集-吸痰 吸痰：无法咳痰或不合作者、人工气道者，戴 好无菌手套，无菌集痰器分别连接吸引器和无菌 吸痰管。按吸痰法将痰吸入无菌集痰器内，加盖 送检。 经支气管镜直接吸引: 注意严格无菌操作 PSB 及BAL 对可疑的VAP患者进行纤支镜保护样本刷（PSB)及支 气管肺泡灌洗(BAL)采样， 以此技术取支气管分泌物不易污染，进行呼吸道感染细 菌定量或半定量培养，若分离细菌浓度 103CFU/ML(PSB)及104CFU/ML (BAL)，可作为诊断 标准，其敏感性为76%一83%，特异性为91%一100%。 通过与尸检对照，已证实PSB和BAL技术诊断的正确性 ，被认为是目前最可靠的诊断方法。 l肺泡灌洗液直接镜检BALD被认为对快速诊断、及早 治疗VAP是一个有价值的方法。 尿标本正确采集-清洁中段尿标本 应保证尿液在膀胱内至少停留4h以上。最好留取早 晨清洁中段尿标本， 方法：患者睡前少饮水，清晨起床后先用肥皂水清 洗会阴部，女性应用手分开大阴唇，男性应翻上包皮 ，仔细清洗，再用清水冲洗尿道口周围；开始排尿， 将前段尿排出，弃去，不要停顿，直接将中段尿约 1020ml直接排入专用的无菌容器中，立即送检。 容器内是无菌的，所以打开容器盖后，应拿在手中 ，不要随意乱放。记录留取标本的时间，保证在留取 标本后1小时内送至检验科。 尿标本正确采集-留置导尿 消毒导尿管外部(接头上端近会阴部）, 按无菌操 作方法用注射器穿刺导尿管吸取尿液10ml，操作时注 意防止混入消毒剂（推荐用三步清毒法： 75乙醇 -2% 碘酒-75%酒精脱碘待干）. 注意不能从收集袋中采集尿液。 血培养标本 采集与运送 血培养标本采集 1.手清洁：无明显污染使用速干乙醇消毒液洗手. 2.血培养瓶口消毒：75%乙醇消毒一遍，待干60 s . 3.静脉穿刺消毒：推荐用三步法 (1).用75乙醇清毒采集部位 (2).用2%碘酒从穿刺点向外画圈消毒，至消毒区域 直径达3cm以上，涂擦穿刺皮肤2遍，待干。 （3）75%酒精脱碘：用75%酒精由内向外方向涂 抹去碘酒液 ,待酒精挥发干燥后采血 。 o2009年美国感染性疾病学会推荐的经皮抽血局部皮肤消毒或导管接口用碘酊 或酒精或酒精氯已定(0.5%),不建议使用聚维酮碘. 采血量 l 成人采血量是10 ml -20 ml /套 l婴儿，35ml/套 操作注意事项 （1）从静脉采血，不建议从动脉采血， （2）用注射器无菌穿刺取血后,勿换针头(如果行第二次 穿刺,应换针头) 直接注入消毒后的血培养瓶。 （3）血抽到培养瓶后,轻轻颠倒混匀以防血液凝固。立即 送检,切勿冷藏！ （4）多次采血应在不同部位的血管穿刺以排除皮肤菌丛 污染的可能。除非无法作静脉穿刺取血，否则不应从留 置导管内取血。 （5）抽血前应将标签贴于血培养瓶颈上，标签内容包括 病人基本信息、采血时间、采血部位。注意不要把标签 贴在培养瓶条形码上，否则仪器无法识别。 血培养次数和采血时间-1 l采血培养应该尽量在使用抗菌药之前进行,在 患者发热期间越早越好，以发热高峰前1h内或病 人寒战和发热开始时采集为宜。在10分钟内于不 同部位采集外周血23 份培养(有助于判断是污 染还是感染，提高检出阳性率) l注意报阳性时间，阳性瓶数. 。 l在采取血培养后的2-5天内，不需要再重复采 取血培养，因为进行治疗后的2-5天血液中的感 染细菌不会马上消失。 对可疑中心静脉导管相关血流感染（CR-BSI ) l保留导管 l外周静脉血1份，中心静脉导管血1份,不用弃去导管起 始部分的血液. l拔除导管: l2个外周静脉血、导管尖端5cm. (在进行中心静脉导管血和 周围静脉血培养时应记录报阳时间) 导管尖段标本的采集 血管内导管尖段标本的采集、送检程序 用75%酒精清洁导管周围皮肤； 无菌操作移动导管，剪取尖端末端5cm，直接 置入无菌试管内或直接置入血平板内； 立即送检（不超过15min），防止干燥。 如因怀疑CRBSI移除皮下埋置式静脉输液港,将该输液港内容物及导 管尖端做定量培养。 血培养常见错误 l培养瓶放冰箱 l瓶橡胶塞上小盖未打开直接穿刺 l抽血后未及时混匀血液凝固 如何正确运送标本 l运送培养基温度应适当 l原则：保持细菌活力 血培养、脑脊液标本：应及时送检，不能及 时送检的标本应置温箱或室温中，切不能放入冰 箱中保存(除病毒、霉菌、分支杆菌培养样本置4 ) 痰、尿等标本：如不能及时送检可置冰箱， 以抑制杂菌生长，但时间不应超过6h。 血培养瓶验收: (1) 检查培养瓶是否有渗漏、破裂或明显污染 。 (2)检查瓶子上的标签与申请单是否相符。 (3)检查血液标本是否适量，血液是否凝固。 各类标本储存的环境 标本采取后应该立即送检,如不能立即送检,储 存的环境的要求 l储存环境标本来源4冰箱- 痰、尿液、粪 便、活检组织、气管冲洗物、导尿管、心包积液 、脓和伤口分泌物等 l室温（25）-血液培养、脑脊液、泌尿生 殖道、眼、耳、鼻、喉、血管导管尖、体液 、 厌氧菌培养标本 *Dr.HU Bijie27 手术切口、烧伤创面与脓液 *Dr.HU Bijie28 皮肤组织标本 （损伤、脓肿、烧伤、渗出液） l标本的选择更大程度上依赖于感染的程度和性质而不是可疑的病 原体。 l对大多数开放伤口，采集前应先去除表面菌群。 l除非有渗出物，干燥、结痂伤口一般不做培养。 l闭合脓肿应取渗出物和脓肿壁标本。 l开放脓肿处理同开放伤口。 l烧伤伤口应在广泛清洗和清创术后采集培养。建议取活检标本， 伤口表面定量培养不一定有意义。 l代表性的标本应采自病灶活动区域或基底部有而不仅仅是脓液。 29 方法 l未破裂脓肿：不能用拭子。消毒覆于脓肿表面的皮肤，用注射器 将脓肿内容物吸出。然后切开脓肿、引流，取部分脓肿壁送检。送 检时，标本都置于厌氧培养基中。 l开放病灶和脓肿：用无菌盐水擦去表面渗出物，用拭子深入溃疡 基底部或边缘部，采集两个拭子，分别做培养和革兰染色，也可对 渗出物做需氧培养。开放病灶不能做厌氧培养。 l烧伤伤口：清创，出现渗出液后以拭子用力采集，仅作需氧培养 。也可送检活检组织标本。 l脓疱或水疱：酒精消毒使之干燥，对于患儿用23号针头挑破脓疱 ，拭子采集脓疱液和基底部标本。 大便标本 粪便标本采集 自然排便后，取有脓血、粘液、组织碎片部分 粪便13g。 液体粪便则取絮状物，一般取13ml，直接装入粪 便容器或保存液或运送培养基中送检。 直肠拭子法 将肛门周围洗净，然后用一根浸过无菌 生理盐水的棉拭子，插入肛门约mm-2cm处，轻轻旋 转，使之与直肠黏膜表面接触，然后取出置于无菌试管 中立刻送至微生物室本法只适用于排便困难患者或婴 幼儿，不推荐使用拭子做常规性病原菌培养。 环境采样 有关采样 l采样方法：采样是决定结果的第一要素！ l采样时间：查问题时以提高检出率为原则。 l培养基：质量问题影响检出率！关注！ l检测条件：注意实验室污染。 l培养条件：注意培养温度、培养时间。 l结果报告：不能零报，报方法最小检出单位。 l应该让懂院感知识的检验人员来采样会更好！ l阳性检出率越高说明检测水平越高 美国的理念 l1970年以前，美国的医院定期对空气和环境 表面（如，地面、墙壁、台面）进行培养 。到 了 1970年，CDC 和美国医院协会（AHA）主张 停止对环境的常规培养，因为医院感染发生率与 空气或环境表面中总的微生物污染水平不相关， 且环境表面或空气中微生物含量的允许水平也没 有有意义的标准 。1970-1975 年，美国有 25% 的医院减少了这种常规的环境培养工作一个 已经持续的趋势 。 什么情况下要求进行环境采样 l四种状况下要求进行环境采样 一是当环境中的宿主或媒介物被认为在疾病传播中有流 行病学意义时，提供疾病或感染暴发的依据 。 第二种情况是在研究过程中进行适当的环境采样。 第三种情况是为了监测潜在的危险环境条件，确认有害 的化学或生物因素的存在，并验证危险因素的成功消除 。 第四种情况是为了质量保证（QA）而采样，以评估改变 感染控制措施取得的效果或是确保设施或系统按照规范 和预期结果执行。 物体表面采样 物体表面细菌总数的检测是评价 l被污染程度 l消毒效果 主要依据 物体表面采样-涂抹法 l涂抹法：将5 cm5 cm的标准灭菌规格板， 放在被检测物品表面，用浸有无菌生理盐水的 棉拭子在规格板内来回均匀涂抹整个方格，并随 之转动棉拭子，剪去手接触部分后，将棉拭子放 入盛有10 ml生理盐水的试管中，充分振摇1min ，作适量稀释后，接种于普通营养琼脂平板上进 行计数，然后根据平板上菌落数得出物品表面每 平方厘米的细菌数 物体表面采样-斑贴法 l斑贴法:按无菌操作方法将5 cm5 cm的无菌 滤纸用灭菌生理盐水浸湿，均匀贴附于物体表面 ，1 min取下放人盛有25 ml灭菌生理盐水试管中 ，充分振摇1 min，作适量稀释后，接种于普通 营养琼脂平板上作菌落计数，同样得出物品表面 每平方厘米的细菌数。 l压印法 压印法 在检验时，只需在现场打开皿盖，将略突出于培养皿口平面的培 养基轻轻往被检物品表面一按，盖上皿盖，在培养箱内培养一定时 间后计菌落数。此数值即为10cm2被检物品表面上的细菌数，无需任 何换算即可同消毒标准和公共场所卫生标准加以比较。十分快捷、 方便，甚至没有无菌室和专门检验人员也可顺利完成操作。是目前 最理想的用于公共场所物品表面细菌污染程度监测的方法。 不规则物品如何采样? 消毒物品表面的监测： l1、采样时间：消毒处理后4小时内进行采样。 l2采样面积：被采面积100cm2 ，取全部表 l 面；100 cm2，取100cm2 。 l3、采样方法： l 用5CM*5CM的标准灭菌规格板放在被检消毒物品表面，用含相 应中和剂无菌洗脱液（5ML）的棉试子在规格板内横竖往返均匀涂擦 各5次并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子投入无菌 洗脱液中，立即送检。 l 小型物体表面的结果计算用cfu/件表示。 1 、采样时间: 在接触病人和从事医疗活动前进行采 样或消毒后立即采样。 2 、采样面积及方法（棉拭方法） 被检人五指并拢，用含相应中和剂无菌洗脱液（5ML ）的棉试子在双手指屈面从指根到指端往返涂擦2次， 并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子 投入无菌洗脱液中，立即送检。每只手面积按照30CM2 计算。 手消毒效果监测 三、洗脱法 该法较其它两种方法采菌量多，但操作较复杂。 取灭菌生理盐水200ml300ml，倒入适当的灭菌 容器内，将待检查的手浸入生理盐水中，反复冲 洗1min2min。然后将冲洗后的水用细菌过滤器 过滤，过滤完毕，将滤膜贴于普通琼脂培养基上 ，37培养24h，计算菌落数。 皮肤粘膜采样方法 用5cm5crn灭菌现格板，放在被检皮肤处；用 没有含相应中和剂的无菌洗脱液的棉拭子1支， 在规格板内横竖往返均匀涂擦各5次，并随之转 动棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子投人 10ml含相应中和剂的无菌洗脱液的试管内，立 即送检。不规则的粘膜皮肤处可用棉拭子直接涂 擦采样。 指压法 取一块普通血琼脂平板，把待检查手的十个 手指的指腹部分别按压在平板表面。然后把 平板放入37温箱内培养48h，计算菌落数 。 l卫生手标准：10CFU/CM2; l消毒手标准：5CFU/CM2 空气微生物监测 l空气污染的监测得到足够重视 l空气微生物研究的范围在不断扩大 l空气微生物的诊断在不断提高 l控制空气微生物的方法不断更新 l对空气微生物采样方法认识不断提高 空气微生物采样方法 一、沉降法 二、浮游菌测定法 * ：将普通营养琼脂平板放在室内各采样点处，采 样时将平板盖打开,扣放于平板旁，暴露 5min，盖 好立即送检。 * 检测方法：将采样平板置37 培养48h，计数并 鉴定细菌。 结果计算： 细菌总数=50000N/（A*T） 沉降平皿法采样方法 空气消毒效果监测： 采样时间： 在消毒处理后、操作前进行采样 采样方法 采样高度： 距地面1.5m（80-150cm）。 布点方法： l 室内面积30m2,设内、中、外对角线三点; l 室内面 积30m2,设4角及中央5点，均距墙 壁1m 平板沉降法缺点 1、平板沉降法属重心沉降，此法只能采集10m左右的粒子，而且 不能作精确定量。因为就单个细菌而言，最大只有几个m，小到1 m以下，所以它只能采集到附着于各种尘埃和气溶胶表面的细菌， 难以采集到悬浮的细菌，而经空气感染更多的是由于悬浮于空气中 的细菌所致。 l缺点 2、采样时受周围气流、粒经大小和粒经沉降速度等因素影响，不能 准确的反应空气细菌的分布水平。 3、奥梅良斯基公式规定：假如100cm2的平皿在空气中暴露5min即 相当于10 l空气中的细菌数，此值是一假定值，无法定量，所以公 式中的矫正数也是很不准确的。 l洁净部空气采样 l（一）采样方法： l1、当送风口集中布置时，应对手术区和周 l 边 区分别检测； l2、当送风口分散布置时，按全室统一布点 l 方 法检测（按室内面积大小布点）； l3、沉降法采样时，用直径9cm的培养皿,在空 气中暴露30min，37 培养24h，培养皿中的菌 落数（cfu）代表空气中沉降下来的细菌数，个/ 皿。 l（二）采样高度： l1、采样点可布置在地面上或不高于地面 l 0.8m 的任意高度上； l2、在手术区检测时应无手术台； l3、当手术台已固定时，检测高度应在台面 l 之上0.25m； 三十万级：面积30m2布放4点，面积30m2布放2点（避开送风 口正下方）。 撞击式空气微生物采样法 采样器分别置于室内对角和中央共3个 点。设置采样时间为每点2min，空气流量 为28.5lmin，细菌培养方法同沉降法。 FA-1型多级撞击式空气微生物采样器 l整个仪器是由采样器以及抽气泵、流量计、玻 璃平皿所组成。 l采样器是6层有微小孔眼的铝合金圆盘。圆盘 下放琼脂平皿，每圆盘间有密封胶圈，在通过三 个弹簧卡子把圆盘牢固地联在一起。每个圆盘上