基因工程5章 基因与载体的连接

第五章 基因与载体的连接 一、概述 二、粘性末端连连接法 三、平端连连接法 四、人工接头连头连 接法 五、同聚物加尾连连接法 *1 一、概述 1、DNA体外重组组： 将目的DNA、载载体DNA 和DNA连连接酶在试试管 中进进行的实验实验 操作过过程。 *2 2、DNA体外重组组的特点： DNA体外连连接减少了DNA分子进进入宿主细细胞后遭 受降解的危险险，增加了转转化效率。 由于限制性内切酶产产生的粘性末端在体外连连接，使 原来酶的识别识别 序列在整个DNA维维持完整性，有利 于在重组组子转转化扩扩增以后再对对外源基因的分离。 连连接时时可以控制连连接反应应条件，有利于形成环环状 分子或者几个DNA片段头头尾相连连接的直线线多联联体 。 *3 3、基因克隆： 是指将外源基因与有自主复制能力的载载体 DNA在体外人工连连接，构建成新的重组组DNA 分子的过过程，又称为为分子克隆。 4、基因亚亚克隆： 是指将较较大的克隆片段经经酶切后，再将所有 的小DNA片段与另一个载载体连连接转转化的过过程 。 *4 5、载载体DNA酶切位点具备备的条件 位于载载体上特定的酶切位点要尽可能少，最好是 单单一酶切位点，这样这样 能保证证目的基因和载载体 DNA以最高的概率正确组组合。 在酶切位点之前要有一个较较强的启动动子，使插入 的目的基因可在该该启动动子的指导导下高效表达。 选择选择 的载载体必须须在连连接重组对组对 基因转录转录 和翻译译 过过程中的编码编码 区读读框不改变变。 *5 二、粘性末端连连接法 (1)单单酶切位点的粘端连连接 (2)不同限制酶切位点连连接 配伍末端连连接 非配伍末端连连接 *9 单酶切位点的粘性末端连接 *10 *11 Bam Bam HH切割反应切割反应 GGATCCGGATCC CCTAGG CCTAGG T4T4 DNADNA连接酶连接酶 1515CC GATCCGATCC G G G G CCTAGCCTAG + 目的基因用目的基因用 Bam Bam HH切割切割载体载体DNADNA用用Bam Bam HH切割切割 重组体重组体目的基因自连目的基因自连 载体基因自连载体基因自连 *12 *13 如何防止载体自连呢 不同限制酶切位点（配伍末端）的连接 *14 *15 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco Eco R R切割位点切割位点BgBg l l切割位点切割位点 + + EcoEcoR R+ + BgBg l l 双酶切双酶切 Eco Eco R R+ + BgBg l l 双酶切双酶切 T4T4 DNADNA连接酶连接酶 1515CC 重组体重组体 双酶切片段双酶切片段 的定向克隆的定向克隆 定向克隆： 使外源DNA ( 目的 基因 ) 片段定向插 入到载体分子的克 隆方案。 *16 定向克隆的优优点： 外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质组质 粒 ，以便目的基因的正确转录转录 和表达。 质质粒载载体与外源DNA结结合处处的限制性内切酶 位点仍然保留，可随时时从重组载组载 体中通过过相应应 的限制性内切酶切割后分离和获获得目的基因。 由于不会发发生自身环环化，转转化率高，转转化后的 细细菌克隆大多数携带带有目的基因的重组质组质 粒。 *17 定向克隆的连连接方式： 外源DNA和载载体DNA经过经过 2个限制性内切酶切割 后为为非同源互补补的粘端连连接(粘端粘端连连接)。 外源DNA和载载体DNA经过经过 2个限制性内切酶切割 后一侧为侧为 二者互补补的粘端，另一侧为侧为 平端或由 非互补补的粘端补补平后产产生的平端两者连连接(粘端 平端连连接)。 *18 *19 三、平端连连接法 适用于限制性内切酶切割产产生的平端 适用于粘端补齐补齐 或切平形成的平端 *20 *21 目的基因目的基因 载体载体 限制性内切酶限制性内切酶 限制性内切酶限制性内切酶 T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶 1515CC 重组体重组体 载体自连载体自连 目的基 因自连 不同粘性末端变成平端连接 *22 当载载体和外源DNA片段两端的酶切位点之间间，不可能 找到恰当的匹配时时，解决方法： 人工接头连头连 接法：通过过依次加入、连连接合成DNA接 头头，再用限制酶切加以解决。 同聚物加尾连连接法：可以利用末端转转移酶分别别在 载载体酶切位点处处和外源DNA片段的3端加上相互补补 的同聚尾加以解决。 PCR法：通过过PCR(聚合酶链链反应应)技术扩术扩 增外源DNA 片段，从而加上合适的限制性内切酶的单单一识别识别 序 列，再用限制酶切加以解决。 *23 四、人工接头头(linker)连连接法 人工接头头：是人工合成的具有一个或数个特定 限制性内切酶识别识别 和切割序列的双股平端DNA 短序列。 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产产 生粘性末端，而进进行粘端连连接。 *24 *26 人工接头连接人工接头连接 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5- 3- Eco R Eco R Eco R Eco R 五、同聚物加尾连连接法 在末端转转移酶(terminal transferase)的作用下 ，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出 粘性末端，再进进行粘端连连接。 *27 人工粘性末端的连接5突出末端 *28 *29 本章重点掌握的内容 概念： DNA体外重组组、基因克隆