外源化学物致突变作用（20151021）

第七章 外源化学物致突变作用 1 【目的要求】 l 掌握外源化学物的致突变作用 l 熟悉致突变作用评价方法 l 了解致突变作用的遗传学基础 2 第一节 概 述 3 遗传 (heredity)：生物物种通过各种繁衍方式来保证世代 间生命的延续，这个过程就是遗传。 遗传是保持其种族特性的根本。 4 一、基本概念 l 变异 (variation)：遗传的稳定是相对的。 生物遗传物质在自我复制过程中可能发生改变； 生物个体发育在受到复杂的内外环境条件影响下，性状 的发育可能有所不同。于是在亲子之间或子代个体之间 出现不同程度的差异，这种差异称为变异。 变异是生物物种推陈出新的来源。 5 一、基本概念 l 突变 (mutation)：生物体遗传物质本身的变化及引起的 变异。 l 因为这种变化起源于基因和染色体，所以突变实际上 是遗传物质的一种可遗传的变异。 l 自发突变 (spontaneous mutation)：极低； l 诱发突变 (induced mutation)：认为的造成突变。 6 一、基本概念 l 遗传毒理学 (genetic toxicology)：研究化学、物理因素及生 物因素等对遗传物质（DNA）及活细胞遗传过程的作用， 以及人类接触致突变物可能引起的健康损伤效应。 l 遗传毒理学主要研究内容： 致突变作用及机制； 应用检测系统发现和探究致突变物； 提出评价致突变物健康危害的方法。 9 一、基本概念 二、遗传学基础 l 1. DNA与基因 DNA：由脱氧核糖、磷酸及碱基组成，其基本成分为四 种核苷酸，形成双螺旋结构，具有精确复制和高度保真 特性，储存了所有的遗传信息。 基因 (gene)：是DNA分子中最小的完整功能单位。基本 作用是决定蛋白质的一级结构，即每个基因决定一条多 肽链或一种酶。基因是生物遗传信息的携带者。 基因组 (genome)：生物体的一套完整单体的遗传物质。 10 核酸的基本组成单位是核苷酸 (nucleotide)。 碱基 戊糖 磷酸 核苷酸 核苷 核酸 DNA的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸 。 RNA的基本组成单位是核糖核苷酸 。 l 2、核苷酸的结构 二、遗传学基础 碱基 DNA、RNA均有 嘌呤 嘧啶 腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T） 尿嘧啶（U） DNA有 RNA有 l 2、核苷酸的结构 每种核酸都含有四种碱基 。 二、遗传学基础 嘌呤(purine) 腺嘌呤(adenine, A) 鸟嘌呤(guanine, G) (1) 碱 基 嘧啶(pyrimidine) 胞嘧啶 (cytosine, C) 尿嘧啶 (uracil, U) 胸腺嘧啶 (thymine, T) （构成RNA） 核糖(ribose) （构成DNA） 脱氧核糖(deoxyribose) (2) 戊 糖 碱基和核糖（或脱氧核糖）通过糖苷键连接形成 核苷(nucleoside) （或脱氧核苷）。 (3) 碱基与戊 糖的连接形成核苷 核苷酸： AMP, GMP, UMP, CMP 脱氧核苷酸： dAMP, dGMP, dTMP, dCMP 核苷（脱氧核苷）和磷酸以酯键连接形成核 苷酸（脱氧核苷酸）。 (4) 核苷与磷酸的连接 5端 3端 核苷酸之间以3 , 5 -磷 酸二酯键连接形成多核苷酸链 ，即核酸。 C G A DNA 与RNA的区别 核酸碱基戊糖 DNAA、G、C、T脱氧核糖 RNAA、G、C、U核糖 l 5、核酸的一级结构 核酸中核苷酸的排列顺序 。核苷酸间差异主要是碱基不同 ，所以也称为碱基序列。 二、遗传学基础 两条链通过碱基间的氢键 相连，A对T有两个氢键 ，C对G有三个氢键，这 种A-T、C-G配对的规律 ，称为碱基互补规则。 维持双螺旋稳定的因素： 横向为氢键，纵向为碱基 间的堆积力。 l 6、DNA的空间结构 二、遗传学基础 l 2. 染色质与染色体 分裂间期细胞核中，光镜下可见一种能被碱性染料着色的物 质，即染色质(chromatin)。染色质由DNA、蛋白、及少量的 RNA组成，形似串珠状的复合体。 间期细胞核中，一般没有染色体结构，只有在细胞分裂时， 染色质才螺旋化并折叠成染色体(chromosome)，故染色质与 染色体的物质组成是相同的。 将体细胞的全部染色体按大小形态等方式排列起来即构成细 胞的核型。每一个生物种属的核型是固定的。 19 二、遗传学基础 串珠状核小体 DNA双螺旋片段 染色质纤维 伸展形染色质片段 密集形染色质片段 整个染色体 21 人类22对染色体及性染色体性染色体扫描电镜图 l 3. 体细胞和生殖细胞 体细胞 (somatic cell)：多数是二倍体细胞，含有两组完全相同的 染色体，其遗传损伤不会传递给下一代。 生殖细胞(gemcell)：多是单倍体，其染色体改变可以传给下一代 。 显性突变无论纯合子还是杂合子，均出现表型异常。 隐性突变如为纯合子，将出现表型异常，如为杂合子，则为 表型正常的携带者。 22 二、遗传学基础 l 4. 基因型与表型 基因型：指控制生物性状的基因组成，是表型形成的根据。 表型：指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体表现 。基因型决定表型可能发育的范围，会产生怎样的表型取决 于生长发育所处的环境。 23 二、遗传学基础 l 5. 细胞周期、有丝分裂与减数分裂 细胞周期：指细胞一次分裂结束后开始生长，到下一次分裂终 末所经历的过程。 细胞周期分为四个时期： G1期(合成前期)是细胞进行急剧合成的时期 S期完成DNA复制 (DNA合成期) G2期(合成后期)为有丝分裂做准备 M期 (有丝分裂期) G1、S和G2为分裂间期 24 二、遗传学基础 有丝分裂(mitosis)：细胞核分裂过程中，一个细胞生成两 个子细胞，每个子细胞具有与亲代细胞完全相同的染色体 。 有丝分裂间期：染色体浓缩成典型的形态，且分散排列在 赤道面上，间期适合做染色体形态和结构方面研究。 减数分裂(meiosis)：是一种特殊的有丝分裂，通过两个细 胞周期，细胞核分裂两次，而染色体只复制一次，使染色 体数目减少一半，成为单倍体。性细胞。 25 二、遗传学基础 The course of mitosis 26 分裂间期 (interphase); 分裂前期 (prophase); 前中期 (prometaphase); 中期 (metaphase); 后期 (anaphase); 末期 (telophase) 有丝分裂 减数分裂 第二节 化学物致突变的类型 28 突变的分类 l 自发突变 (spontaneous mutation) 普遍存在的未知因素作用下，自然条件下发生的突变。 特点：发生过程长，频率极低 , 与物种的进化有关。 l 诱发突变 (induced mutation) 人为的造成突变 。它已被农、林、牧、渔业和园艺学家利用 来培育和选择新种或良种。 特点：发生过程短，频率高，既可被人类利用，也可能对人 类产生危害。 29 突变的分类 l 基因突变 (gene mutation)： 一个或几个DNA 碱基对的改变。用光学显微镜观察不 到，必须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断 。 l 染色体畸变 (chromosome aberration)： 染色体的结构及数目改变，可用光学显微镜进行观察。 染色体结构改变 染色体数目改变 30 一、基因突变 l 基因突变（gene mutation）：指基因中DNA序列的变化。因为 基因突变限制在一个特定的部位，故称为点突变(point mutation) 。 l 突变基因：存在突变的基因 野生型基因：没有发生突变的基因 l 基因突变可分为两种类型： 碱基置换(base substitution) 移码突变 (frame shift mutation) 31 l 1. 碱基置换 (base substitution) 某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。 当DNA链上某一碱基由于致突变物作用而脱落或其配对性能 发生改变，在DNA复制过程中该DNA互补链上的相应位点配 上一个错误的碱基，即错误配对(mispairing)。这一错误配对的 碱基在下一次DNA复制时，按正常规律配对，于是原来的碱 基对被错误碱基对所置换，称碱基置换。 一、基因突变 32 A A C TG G C TTG AC C G A A C TG G C TTG AT C G TTG AC C G A A CTG G C A A C TG G C TT G AC C G TT G ATC G A A C TA G C A A C TG G C TT G AC C G TT G AC C G A A C TG G C Parental DNA DNA replication First generation progeny 3 5 5 3 Second generation progeny Wild type MUTANT Wild type Wild type DNA replication Mismatch (about 1/1000 base additions) 33 l 碱基置换的分类 转换(transition)：指原来的嘌呤被另一个嘌呤所取代或原来的 嘧啶被另一个嘧啶所取代。 颠换(transvertion)：指原来的嘌呤被另一个嘧啶所取代或原来 的嘧啶被另一个嘌呤所取代。 34 错义突变：密码子中某一碱基为另一碱基取代后，密码子意义 改变，成为另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种 类和序列发生改变。错义突变的结果通常能使多肽链丧失原有 功能，许多蛋白质的异常就是由错义突变引起的。 无义突变：碱基取代的结果是使mRNA上的密码子转变成为终 止密码UAA、UAG、UGA时，出现翻译过程停止，肽链延长提 前结束。基因产物是不完全的或无功能的。 l 碱基置换的后果 35 l 2. 移码突变 (frameshift mutation) 发生一对或几对（3对除外）碱基减少或增加，以致从受损点 开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正 常的氨基酸。 从受损位点开始密码子的阅读框架完全改变。 如果减少或增加的碱基对刚好是3对，则基因产物的肽链中仅 减少或增加一个氨基酸，其后果与碱基置换相似，故不包括 在移码突变范畴。 36 l 移码突变的结果 错义突变：从原始损伤的密码子开始一直到信息末端 的氨基酸序列完全改变。 无义突变：使读码框架改变其中某一点，形成无义密 码 （UAA，UAG及UGA），不代表任何氨基酸，产生 一个无功能的肽链片段。 移码突变较易成为致死性突变。 37 l 染色体畸变(chromosome aberration)：指染色体的结构改变， 它是指遗传物质大的改变，一般可在细胞有丝分裂中期通过 光学显微镜检查发现。 染色单体型畸变(chromatid-type aberration)：畸变涉及复制染 色体中两条染色单体中的一条，损伤发生在DNA复制后； 染色体型畸变(chromosome-type aberration)：畸变涉及复制染 色体中两条染色单体，损伤发生在DNA复制前。 二、染色体畸变 38 l 染色体结构异常是染色体或染色单体断裂所致。当断端不 发生重接或虽重接而不在原处，即可出现染色体结构异常 。 二、染色体畸变 39 l 染色体结构异常的类型 缺失(deletion)：染色体上丢失了一个片段。 重复(duplication)：在一套染色体里，一个染色体片段出现 不止一次。 倒位(inversion)：一个染色体片段被颠倒了，如颠倒的片段 包括着丝点，称为臂间倒位(pericentric inversion)；如不包括着 丝点则称为臂内倒位(paracentric inversion)。 易位(translocation)：一个染色体片段的位置发生改变。最常 见的是相互易位(reciprocal），涉及两个非同源染色体片段的 交换。 40 稳定性畸变：可传给后代，缺失、倒位、重复及平衡易位； 不稳定畸变：可导致细胞死亡，染色体断裂后无中心粒、双中 心粒染色体、环染色体等。 41 l 非整倍体（aneuploidy）和多倍体（polyploidy）细胞的染色体 数目不同于正常细胞染色体数目，称为基因组突变，即基因 组中染色体数目改变。 非整倍体：指增加或减少一条或几条染色体； 多倍体：指染色体数目成倍增加。 三、非整倍体和多倍体 42 第三节 化学物 致突变作用的机制及后果 43 一、引起突变的DNA变化 l 碱基损伤 碱基错配 平面大分子嵌入DNA链 碱基类似物取代 碱基的化学结构改变或破坏 l DNA链受损 二聚体的形成 DNA加合物形成 DNA-蛋白质交联物 44 （一）碱基损伤 l 1. 碱基错配 指烷化剂提供甲基或乙基等烷基与DNA共价结合，所引起 的甲基损伤表现为错配。 一般情况下，发生频率：甲基化乙基化高碳烷基化 目前认为最常受到烷化的是： 鸟嘌呤的N-7位，O-6位 腺嘌呤的N-1， N-7位 45 腺嘌呤 (adenine, A) 鸟嘌呤(guanine, G) l 烷化的碱基既可表现出像正常碱基一样的配对特性，也可有 不同的配对特性，主要取决于烷化的位置。 l 在鸟嘌呤N-7上的烷化有正常配对特性，而在鸟嘌呤O-6上的 烷化易错配，引起G:C-A:T转换。 l 烷化剂不但可引起碱基错配，还可引起DNA二级结构改变 。 某些烷基(如鸟嘌呤N-7位上的烷基)，是由许多烷化剂形 成的主要加合物，造成碱基与脱氧核糖之间的连接键不 稳定，使碱基丢失。丢失碱基的DNA留下了一个无嘌呤 或无嘧啶的位点，通常称AP位点。如果不正确的碱基插 入AP位点，可引起突变，且大部分是颠换。 46 l 2. 平面大分子嵌入DNA链 嵌入剂以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双 螺旋结构的相邻核苷酸链之间； 吖啶分子多数是多环的平面结构，能结合到DNA分子上， 插入相邻的碱基对，使它们分开，产生两个重组子，一个 碱基对增多，一个碱基对减少，即造成碱基对的缺失或者 额外碱基对的插入。通常引起移码突变。 （一）碱基损伤 47 l 3. 碱基类似物取代 碱基类似物在DNA合成期即S期，与正常的碱基竞争， 取代其位置。取代后造成错误配对，即发生碱基置换。 常见的例子是5-溴脱氧尿嘧啶取代胸腺嘧啶，2-氨基嘌 呤取代鸟嘌呤。 （一）碱基损伤 48 l 4. 碱基的化学结构改变或破坏 有些化学物可对碱基产生氧化作用，改变或破坏碱基的结构 ，有时还可引起链断裂。它们主要改变核苷酸的化学组成。 亚硝酸盐能使腺嘌呤和胞嘧啶发生氧化性脱氨，相应生成次 黄嘌呤和尿嘧啶。 甲醛可在体内形成有机过氧化物或自由基，间接使嘌呤的化 学结构破坏，最终导致DNA链的断裂。 （一）碱基损伤 49 l 1. 二聚体的形成 紫外线环丁烷嘧啶二聚体和(4-6)光产物(4-6- photoproduct) 阻止DNA的复制引起细胞死亡 紫外线的致突变作用过程很复杂，表明突变作用不仅涉及 碱基配对特异性的改变，而且还涉及与复制和修复有关的 细胞机制相互作用。 （二）DNA链受损 50 l 2. DNA加合物形成 活性化学物质与细胞大分子之间通过共价键形成的稳定复合 物。可引起碱基置换或移码突变。 DNA加合物形成可活化癌基因，影响调节基因和抑癌基因 的表达。例如：生物毒素、多环芳烃和芳香氨类致癌物可使 DNA形成大的加合物，DNA的立体构象发生明显变化，阻 断受损部位的半保留复制和转录。 （二）DNA链受损 51 l 3. DNA-DNA交联 (DNA-DNA crosslinks，DDC) DNA分子上一条链的碱基与互补链上的相应碱基形成共 价连接，如亚硝酸、丝裂霉素C、芥子气以及各种铂的衍 生物。 （二）DNA链受损 52 l 4. DNA-蛋白质交联物(DNA-protein crosslinks，DPC) 许多化合物如烷化剂、苯并(a)芘、甲醛及一些重金属镍、铬 等，均可引起DNA-蛋白质发生交联。虽然不同化学物引起 DNA-蛋白质交联物的交联有所不同，但DPC一旦形成，必 将对DNA构象与功能产生严重影响。 与DNA交联的核蛋白作为维持DNA构象的重要成分，并参 与DNA复制与转录的调控，因此DPC出现将造成基因突变 。 （二）DNA链受损 53 二、引起突变的细胞分裂过程的改变 l 染色体分离异常，产生非整倍体和多倍体。主要涉及细 胞分离过程改变，如纺锤体、微管蛋白合成与聚合、微 管蛋白合成与功能发挥、细胞分裂纺锤纤维功能发挥等 ； l 非整倍体与多倍体产生机制相似，可能有程度上的不同 ，如干扰纺锤体形成，完全阻止形成多倍体，部分阻止 形成非整倍体。 54 DNA复制需多种酶类的参与，并且在基因调控下进行，这 个过程中的任何一个环节损伤，将影响DNA复制的高保真 性，有可能引起突变。 修复修复酶可能成为化学毒物的靶分子 DNA修复过程是清除受损DNA片段，并合成新的片 段来替换的过程。 DNA是生命物质中唯一具有自身修复能力的分子， 其修复过程是依赖各种各样的酶来进行。 三、DNA合成和修复有关的酶系统作用 55 l 突变的后果，取决于化学物所作用的靶细胞， 生殖细胞，其影响有可能遗传到下一代。 体细胞，其影响仅能体现在直接接触该物质的个体，而不可 能遗传到下一代。 四、突变的后果 56 57 l 基因库（gene pool）：某一物种在特定时期中能将遗 传信息传至下一代的处于生育年龄的群体所含有的基 因总和。 l 遗传负荷(genetic load)：指一种物种的群体中每一个 携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平。 （一）生殖细胞突变的后果 58 （一）生殖细胞突变的后果 l 致死性突变（影响后代数量） 显性致死：突变配子与正常配子结合后，使精子不能受精，合 子在着床前丢失或着床后早期胚胎死亡； 隐性致死：需要纯合子或半合子才能出现死亡效应，杂合子则 不出现死亡，可造成生育功能障碍。 l 非致死性突变（影响后代质量） 显性遗传：造成下一代遗传疾病发生率增加或新病种出现； 隐性遗传：使得遗传易感性改变，增加下一代基因库的遗传负 荷。 59 l 肿瘤：体细胞突变是细胞癌变的重要基础，许多肿瘤细胞中都 可观察到癌基因的活化和抑癌基因的失活，并存在缺失、重复 、易位、倒位等染色体畸变。 l 致畸胎：致突变物可透过胎盘作用于胚胎体细胞引起畸胎，所 以致畸作用不完全是亲代生殖细胞突变的后果。 l 其他不良后果：动脉粥样硬化、衰老等。 （二）体细胞突变的后果 60 第四节 机体对致突变作用的影响 61 l 遗传信息在所有物种中，均是世代 相传，因为： DNA执行高保真度的半保留复制 ，对复制中的错误能及时纠正； 机体可以修复DNA损伤，保护亲 代DNA链免受化学物作用而发生 改变。 62 DNA修复 直接修复 切除修复 适应性修复 光修复 错配碱基修复 碱基切除修复 核苷酸切除修复 复制后修复 呼救性修复 l DNA修复机制： 直接修复：指引起DNA损伤的反应为可逆性的，如光修复。 切除修复：将损伤或不正确的甲基去除和替换，如核苷酸或碱基 去除，它是负责较大范围损伤的修复。 63 一、DNA损伤的修复 （一）直接修复 （1）光复活：紫外线损伤产生胸腺嘧啶二聚体，光复活依赖光裂 合酶的作用，酶切下DNA上的嘧啶二聚体，将毗连的嘧啶接回原 结构上，光裂合酶广泛存在于原核生物和真核生物体内。 光裂合酶 (photolyase) UV 64 （2）“适应性”反应：鸟嘌呤O-6位易被烷化，造成碱基错配， 这时可依赖烷基转移酶作用，将鸟嘌呤O-6位的甲基转给蛋白质 O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基化转移酶（MGMT），修复烷基化损 伤，鸟嘌呤恢复正常的碱基配对特性。MGMT广泛存在于酵母、 大鼠及人类。 （一）直接修复 65 腺嘌呤 (adenine, A) 鸟嘌呤(guanine, G) （1）核苷酸切除修复 E.coli的切除 修复机制 UvrA UvrB UvrC OH P DNA聚合酶 OH P DNA连接酶ATP 解螺旋酶 物体内最重要和有 效的修复机制，主 要由DNA-pol和 连接酶完成。 （二）切除修复 66 （2）碱基切除修复 DNA糖基化酶识别异常碱基，切断 碱基与脱氧核糖之间的键，使受损 的碱基脱落，形成一个无嘌呤或无 嘧啶位点（AP位点）； AP内切酶将DNA链切断； 插入酶将正确碱基插入AP位点； DNA聚合酶合成DNA片段填补空缺 ； DNA连接酶将新合成的互补片接上 。 与核苷酸切除修复相比，碱基切除 修复的专一性更强。 67 双链断裂修复依赖DNA蛋白激酶，通过填补损伤部 位，使复制得以继续进行，但DNA损伤部位仍然存 在。 严格来说，双链断裂修复不是修复，而是一种耐受过 程，一种以容忍损伤继续存在和在高突变率情况下， 换取细胞继续生存的耐受过程。 （三）双链断裂修复 68 无误交联修复： 易误交联修复： （四）交联修复 69 l 致突变作用是一个涉及多元因素相互作用的复杂细 胞过程，它包括突变、修复和代谢。对于化学致突 变作用的模式应为DNA损伤-修复-突变模式。 任何DNA损伤，修复无误，突变就不会发生； 如果修复错误或者未经修复，损伤就固定下来，于 是发生突变。 （五 ）DNA损伤-修复-突变模式 70 二、遗传因素对致突变作用的影响 l 个体因素影响致突变作用有两个方面： 先天因素：即遗传因素，也就是遗传多态性。 后天因素：主要指不良的生活方式，如吸烟、饮酒、营 养缺乏或不平衡等。这些因素是产生突变的条件。 71 二、遗传因素对致突变作用的影响 l （一）代谢酶遗传多态性 是一个衡量遗传变异的数据，即群体中多态基因的比例。 当一个基因座位的最常见的等位基因频率不超过0.99时， 这个基因座位即是多态性。它在个体因素影响致突变作用 中起决定作用。如代谢酶和修复酶的遗传多态性。 1. 氧化代谢酶细胞色素P450酶 2. 酯酶环氧化物水解酶 3. 谷胱甘肽硫转移酶(GST) 72 二、遗传因素对致突变作用的影响 l （二）修复功能的个体差异： 修复酶多态性 O6甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）是特异性修复酶。 MGMT多态性可解释某些个体对烷化剂作用特别敏感的现象。 聚（二磷酸腺苷-核糖）多聚酶（PARP）是另一类参与DNA断 裂的修复酶。PARP的激活为DNA损伤后细胞的早期反应之一 ；催化反应为DNA损伤一系列反应之一；影响DNA修复和损 伤结局；对外来因素造成基因突变和肿瘤发生可产生抑制和诱 导作用。 73 第五节 观察化学物 致突变作用的基本方法 74 一、观察项目的选择 基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学物的致突变性 ，是评价化学物致突变性唯一可靠方法。 但许多试验所观察到的现象并不直接反映基因突变、染色体 畸变和染色体分离异常，仅反映致突变过程中的其他事件。 将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点 (genetic endpoint)。 基因突变、染色体畸变、染色体组畸变、DNA原始损伤 （一）观察的效应终点类型 75 （二）遗传毒理学试验的目的 检测外源性化学物的致突变性，预测其对动物和人类的 致癌性； 检测外源性化学物对动物生殖细胞的遗传毒性，预测其 对人类的遗传危险性； 预测潜在的致癌物以及遗传毒物的监测及评价。 76 一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。如 细菌突变、染色体畸变、非整倍体和DNA损伤等； 配套实验应包括多种进化程度不同的物种。如原核细胞 、低等和高等真核细胞，这样更加具有说服力。 体内试验与体外试验配合。一般体内试验和体外试验各 有其优缺点，应取长补短，综合考虑。 （三）成套的观察项目 77 国际协调委员会（International commission on harmonization, ICH, 1997），建议监测组合: 细胞基因突变试验； 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细 胞tk试验； 体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验（骨髓细胞染色体 畸变试验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验）； 78 二、常用的致突变试验 1. 细菌回复突变试验 (Ames试验) 细菌回复突变试验是利用突变体的测试菌株，观察受试物 能否纠正或补偿突变体所携带的突变改变，从而判断其致 突变性。其遗传学终点是基因突变。 常用的菌株有鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimmIm)和 大肠杆菌 (E Coli)。 目前，Ames试验作为检测环境诱变剂的一组试验中的首 选试验，广泛应用于致突变化学物的初筛。 79 野生型能自行合成组氨酸（ his+），而诱变突变株在组氨 酸操纵子中有一个突变，必需 依赖外源性组氨酸才能生长， 而在无组氨酸的选择性培养基 上不能存活（his-）。 致突变物可使其基因发生回复 突变为野生型，在缺乏组氨酸 的培养基上也能生长。对于间 接致突变物，可经代谢活化系 统处理成为直接致突变物。 鼠伤寒沙门氏菌 80 81 82 Ames试验标准试验菌株有四种。除了含有his-突变，还有一些附加突 变，检测时提高试验敏感性。 Ames试验的方法有平板掺入法，点试法及预培养法等。 83 菌株 组氨酸 缺陷 脂多糖屏 障缺损 氨苄青霉 素抗性 切除修复 缺损 四环素 抗性 自发回变 菌落数* TA97 TA98 TA100 TA102 + + + + + + + + + + + + + + + - - - - + 90-180 30-50 100-200 240-320 注 “+”表示 需要组氨 酸 “+”表示 具有rfa突 变 “+”表示 具有R因 子 “+”表示 具有 uvrB突 变 “+”表示 具有 pAQ1质 粒 *在体外代 谢活化条 件下自发 回变菌落 数略增 试验菌株及鉴定判断标准 84 测试菌株的回变性 85 结果判断 只要一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物 。 仅四种菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。 不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物。 加S9混合液才得到阳性结果，说明受试物是间接致突变物。 86 2. 微核试验 (micronucleus test, MNT) l 微核 (micronucleus)：指染色体或染色单体无着丝点断片，或因 纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在子 细胞的胞质中，单独形成一个或几个规则的次核，故称微核。 l 在细胞质中微核来源有二： 染色体断片或无着丝粒染色体，在细胞分裂后期不能定向移动 ，而遗留在细胞质中； 有丝分裂物的作用使个别染色体或带着丝粒的染色体环和断片 在细胞分裂后期被留在细胞质中。 87 l 微核试验(micronucleus test，MNT)：是观察受试物能否产生 微核的试验。可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。 l 微核试验的灵敏度与细胞遗传学试验基本相同。 l 常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞（PCE）做微核试验。 88 2. 微核试验 (micronucleus test, MNT) 为什么要选用PCE？ 骨髓红细胞有丝分裂旺盛，造成一个较为灵敏的检测环境； 嗜多染红细胞是红细胞成熟过程中的一个阶段，位于红细胞成熟之前 ，最后一次分离后数小时，此时红细胞的主核已排出，而微核留在细 胞质中； MNT的缺点 有些化合物在骨髓中很难达到有效浓度； 骨髓中PCE为动态平衡，成熟或衰老死亡； 化学毒物主要在肝脏活化，其活化中间产物可能在到达骨髓前消失； 仅观察体细胞其结果外推其他组织应慎重。 89 90 体外微核试验：CHO、CHL、V79 周围血微核试验 双核细胞法 免疫荧光染色法和荧光原位杂交法 改进的微核试验 91 MN NCE NCE（normochromatic erythrocyte）正染红细胞 PCE（polychromatic erythrocyte）嗜多染红细胞 92 93 试验步骤 健康成年ICR小鼠，实验前24h环磷酰胺40 mg/kg腹腔注射； 脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端 骨垢，用注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管 ，然后用吸管吹打骨髓团块混匀； 1000r/min离心 10 min，弃上清，留约0.5 ml沉淀物混匀后，滴片两张 ，推片； 将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15min，取出晾干。 将固定晾干后的骨髓片，Giemsa染色1015min，轻微冲掉玻片上的 染色液，置晾片架上晾干。 显微镜观察并计数微核率。 94 PCE呈灰蓝色，成熟RBC呈粉红色，NC呈蓝紫色。 PCE中含有的微核大小为细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或椭圆 形，边缘光滑整齐，染色性与细胞核一致，呈紫红色或蓝紫 色。一个细胞内可以出现一个或多个微核。每张片计数1000 个PCE中含微核的PCE数。 95 试验步骤 3. 染色体畸变分析 染色体畸变分析(chromosome aberration analysis)：观察染色体 形态结构和数目改变，又称细胞遗传学试验(cytogenetic assay) 。染色体畸变只能在细胞分裂中期相进行观察和分析。可观 察到裂隙、断裂、断片、染色体环、双或多着丝粒染色体和 染色体粉碎。 缺点：分裂中期相分析耗时且需熟练技巧。 96 97 试验步骤 染毒：健康成年ICR小鼠，实验前24小时予环磷酰胺40 mg/kg 腹腔注射。 收获细胞：处死动物前24h，秋水仙碱4mg/kg腹腔注射。脱臼 处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端 骨垢，用注射器吸NS约5 ml插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管 ，吸管吹打骨髓团块混匀，1500 r/min离心10min，弃上清。 低渗：打散沉淀物，加入预温37的 0.075 mol/L KCl约6ml， 混匀，37低渗1520min，再加固定液 l2 ml混匀，立即以 1000r/min离心10min，弃上清。 98 固定：重悬细胞，加入固定液4ml混匀，放置室温1020 min ，然后1000 r/min离心10 min，去上清液。同样方法再固定一 次，弃上清液，留约0.5 ml。 制片染色：使细胞悬浮，用吸管吸取细胞悬液，距预冰冻的 载波片1015Cm高处滴片，干燥，用10Giemesa染色液染色 1020min，轻微冲洗，自然晾干。 阅片计数。 99 试验步骤 l 染色体数目改变包括： 整倍体变异：原先2n的染色体变为多倍体如3n或4n等。 非整倍体变异：染色体组中的个别染色体增加或减少。 l 染色体结构改变包括：裂隙(G)、断裂(B)、碎片(F)、环形(r)、 交换(E)以及复合性断裂等。 l 小鼠和大鼠的染色体核型都为近端着丝点型。小鼠的染色体 数为40条，大鼠的染色体数为42条。 l 读片时每张标本片至少要分析100个中期分裂细胞。 100 101 4. 姐妹染色单体交换试验 l 姐妹染色单体：从DNA合成期染色体复制至有丝分裂后 期中心粒分裂这段时间，由同一个中心粒连在一起的二 条子染色体称为姐妹染色单体。 l 姐妹染色单体交换(sister-chromatid exchange，SCE)：二 条姐妹染色单体之间的物质交换就称为姐妹染色单体交 换。即染色体同源座位上DNA复制产物的相互交换。如 单体内DNA链受损，则可能通过这种交换方式进行重组 修复。 因此SCE的出现常表明DNA曾经受损。 102 l将 5-BrdU加入合成DNA的原料中，经过两个分裂周期 后，两条染色单体的其中一条双股DNA链内胸腺嘧啶 核苷均被BrdU取代，另一条只有一股被取代。 l染色和光处理后，两条染色单体的着色深浅不同。如果 两条染色单体间发生等位交换，可根据每条染色单体内 出现深浅不同的染色片段，在光镜下进行识别，清晰分 辨出交换的染色单体，计数SCE数，判断受试物对DNA 是否有损伤作用。 姐妹染色单体交换试验原理 103 104 105 5. 程序外DNA合成试验 l 正常细胞需经过细胞周期达到增殖的目的，细胞周期 包括G1期、S期、G2期和M期，在S期的DNA合成是按 固定程序进行的，称为程序性DNA合成(scheduled DNA synthesis)。 l 当DNA损伤时，会发生在S期半保留DNA程序合成之 外的DNA合成，称之为程序外DNA合成(unscheduled DNA synthesis, UDS)。它是机体为保证遗传稳定性而 对DNA双链上出现的变异或损伤进行修复合成的过程 。 106 程序外DNA合成试验原理 l 程序外DNA合成试验是观察分离或培养的细胞，加入 标记DNA合成原料，如3H-胸苷，在S期外是否有DNA 合成发生，即是以3H-胸苷掺入细胞量的增加，判断受 试物是否造成DNA损伤。 107 6. 单细胞凝胶电泳(SCGE)试验 l 单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)试验： 在单细胞水平定量检测有核细胞DNA损伤与修复的方法。 l 原理：DNA损伤时，断裂DNA片段在电泳时泳动速度比大 片段DNA快，出现彗星状，即可判断DNA损伤。故又称为 彗星试验（comet test)。 l 优点：此方法检测低水平DNA损伤的敏感性高，对样品的 细胞数要求少，适应性高，操作简便，省