基因工程与药物

单击此处编辑母版标题样 式 单击此处编辑母版副标题样式 *1 n基技学院 严永敏 n 单击此处编辑母版标题样 式 单击此处编辑母版副标题样式 *2 概 念 基因重组（genetic recombination）： 指不同来源的DNA分子通过重新组合（插 入、缺失、置换等）形成新的重组DNA分子 的过程。 自然界的基因重组 一、转化作用 概念：受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并 使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞部分 遗传性状的现象。 DNADNA片段 新DNA 重组 摄取 溶解 转导作用 概念：以病毒为媒介发生在供体细胞与受体细 胞之间的DNA转移及基因重组。 转位： 概念：基因从基因组的一个位置转移到另一个位 置。 n第一节 概述 n第二节 基因工程相关的酶学 n第三节 基因工程的载体（vector） n第四节 目的基因制备和常用分离方法 n第五节 载体DNA和目的基因的连接 n第六节 重组DNA分子引入受体细胞 n第七节 重组体的鉴定与分析 n第八节 克隆基因的表达 基因工程（genetic engineering ）： 在体外应用人工方法进行基因重组，然后导 入宿主细胞去复制、扩增或表达的过程。因为通 过人工设计,得到一定的设计方案，故称为基因工 程。 分子克隆（molecular cloning ） : 指按照人的意愿，在体外将制备的DNA片段与 载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复 制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝或表达产 物。 分 切 连 转 筛 基因工程步骤 基因工程 基因工程技术的应用(P307) 一、生产（基因工程）产品： 1.构建基因组文库，cDNA文库，核酸探针等 2. 生产基因的(用于医药目的)的一级产品，即蛋白质、多肽；二级 产品，如维生素、多糖、氨基酸(因为它们由酶催化产生） 3. 生产基因疫苗、如:乙肝疫苗. 二、改良生物的性状 如将固氮基因引入水稻,就可以不用施氮肥了 基因治疗 三、分子诊断 在分子克隆技术中，对DNA进行切割、合成 、补平、连接和修饰等工具酶是必不可少的。 常用的工具酶主要有： 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、逆转录 酶、DNA连接酶、碱性磷酸酶、多核苷酸激酶和 末端脱氧核苷酸转移酶，甲基化酶等。 重要的工具酶（tool enzyme) 一、限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease，RE） 简称限制酶，是一类能识别和切割特定DNA序 列的核酸内切酶，为原核生物所特有。 分为三型。其中型被称为基因工程的分子 剪刀，是分子克隆技术中最重要的工具酶。 作用 三种限制性核酸内切酶的作用(P309) 酶活性 核酸内切酶 核酸内切酶 核酸内切酶 甲基化酶 甲基化酶 ATP酶 DNA解旋酶 DNA链上的 无 有 有 特异识别位点 DNA链上的 无 在识别序列内 在识别序列外 特异切割位点 在分子克隆中 无 有 无 的重要意义 （一）限制酶的命名与分类 EcoR I 产生该酶的 宿主菌属名 微生物 的种名 宿主菌的 株或型 同一菌株中不同 限制酶的编号（ 按发现先后顺序） 大肠杆菌Escherichia属、coli种、RY13株中 分离到几种限制酶，分别表示为: EcoR I 、EcoR 、EcoR 等。 （二）型限制性核酸内切酶的作用 根据需要在特定的位点上精确切割双链 DNA分子，产生特异末端的DNA片段。 识别序列：双链DNA特异的碱基对（一般46个）， 在识别序列内特异切割DNA。 断裂磷酸二酯键 单击此处编辑母版标题样 式 单击此处编辑母版副标题样式 *18 型限制酶的特异识别序列 回文结构（palindrome structure）： 指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列。 5GAATTC3 AT AT GC 5 3 EcoR 识别序列 ： 对称轴 3CTTAAG5 单击此处编辑母版标题样 式 单击此处编辑母版副标题样式 *19 粘性末端（cohesive end）： 指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所 产生的带单链突出的末端。 GAATTC CTTAAG 平末端（blunt end）： 指限制酶在对称轴上同时切割互补DNA双链所产 生的末端。 EcoR CCC GGG GGG CCC Sma 4 同裂酶（isoschizomers）: 来源不同，但能识别和切割同一核苷酸序 列的限制酶，也称异源同工酶。 这些同工异源酶可以互相代用 。 如：BamH 和Bst （G GATCC）； Xho 和 Pae R7（C TCGAG）。 如： BamH （G GATCC） 和Sau 3A （N GATCN）。 同尾酶（isocaudamers）: 来源，识别序列，且切割方式均不同，但 可产生相同粘性末端的限制酶 。 产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，在DNA重 组时具有更大的灵活性。 “分子剪刀”的应用 根据特异识别序列切割DNA片段 用于基因组计划研究（如物理图谱)，基因组文库，DNA 序列分析, DNA分子杂交，制备探针） 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphysm，RFLP）研究，用于法医学个体 识别和遗传性疾病的诊断等DNA指纹分析 人类两个个体的基因组DNA中平均有1000万处不同，多位于 非编码序列中。碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出 现，当使用同一限制酶切割不同个体基因组DNA时，DNA片段长度 出现差异，这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差 异，称为RFLP 。 限制性片段长度多态性 (restriction fragment length polymorphism, RFLP ) GAATTC CTTAAG GATTTC CTAAAG 1 2 1 2 I II 2kb 3kb 5kb 7kb 个体识别 RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性 变异，它按照孟德尔方式遗传。 RFLP在遗传病检测中的应用 镰状细胞贫血症（ globin，6 ），其 GAGGTG的突变（Mst II，CCTNAGG） 一、限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease，简称限制酶） ，分为三型 。其中型被称为基因工程的分子手术刀 ， 是分子克隆技术中最重要的工具酶。 甲基化 限制酶 作用 三种限制性核酸内切酶的作用 酶活性 核酸内切酶 核酸内切酶 核酸内切酶 甲基化酶 甲基化酶 ATP酶 DNA解旋酶 DNA链上的 无 有 有 特异识别位点 DNA链上的 无 在识别序列内 在识别序列外 特异切割位点 在分子克隆中 无 有 无 的重要意义 （二）型限制性核酸内切酶的作用 限制酶功能：根据需要在特定的位点上 精确切割双链DNA分子。 型限制酶能识别双链DNA特异的 46个碱基对，并在此序列内特异切割 DNA。 回文结构（palindrome structure）： 指双链DNA分子上按对称轴排列的 反向互补序列（常为限制酶所识别）。 5GAATTC3 AT AT GC 5 3 EcoR 识别序列： 对称轴 3CTTAAG5 粘性末端（sticky end）： 指限制酶错位切开两条对称轴互补 DNA双链所产生的末端。 GAATTC CTTAAG 平末端（blunt end）： 指限制酶平齐切开两条对称轴互补 DNA双链所产生的末端。 EcoR CCC GGG GGG CCC Sma 图4-1 回文结构和限制性核酸内切酶作用模式图 二、DNA连接酶 基因工程的缝纫针 主要功能:催化两个互补粘性末端或平末端双链 DNA分子的5磷酸基团与3羟基形成磷酸二酯键， 将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来，实 现DNA体外重组。 包括大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶。 图4-4 DNA连接酶作用模式图 大肠杆菌DNA连接酶只能连接粘性末端 ，而T4DNA连接酶既能连接粘性末端，又能 连接平末端。 三、DNA聚合酶 （一）DNA聚合酶和Klenow片段 大肠杆菌DNA聚合酶（ E . Coli DNA polymerase ）是单一多肽链的 多功能酶，分子量为109kD，它具有3种 酶活性： 5 3 DNA聚合酶活性。 3 5 核酸外切酶活性。 5 3 核酸外切酶活性。 Klenow片段的主要用途： 补齐双链DNA的3末端，同时可使3 末端DNA 标记同位素。 cDNA克隆中，合成cDNA第二链。 图4-2 DNA聚合酶 和 Klenow片段 53外切酶 53聚合酶 35外切酶 DNA 聚合酶 (103kD) Klenow 片段 N C 53聚合酶 35外切酶 (68kD) 35kD (小) 68kD(大) C N 枯草杆菌 蛋白酶 （二）Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶（简称Taq 酶）是 一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd ，最佳作用温度是7080，Taq酶具有 53 聚合酶活性和依赖于聚合作用的 53外切酶活性。Taq DNA聚合酶可用 于DNA测序及通过聚合酶链反应（PCR ）对DNA分子的特定序列进行体外扩增 。 RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP）。 核糖核酸酶H活性（RNaseH） 。 DNA聚合酶活性（DDDP）。 逆转录酶的作用： （三）逆转录酶 逆转录酶（reverse transcriptase）是依 赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4 种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称 为逆转录过程。逆转录酶是多功能酶。 5 33 5 RNA (用 表示) RNA-DNA 杂化分子 3 5 RNase （ 核酸酶H活性) DDDP （ DNA聚合酶活性） 4种dNTP RDDP （逆转录酶） 引物、4种dNTP 病毒双链DNA 用 表示 ） （cDNA第二链 (complementary DNA，cDNA ) 与病毒RNA 互补的DNA (用 表示) 5 3 3 5 53 5 3 图4-3 逆转录酶的作用 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT，简称 末端转移酶）分子量为60Kd，在二价阳离 子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单 链或双链DNA分子的3末端-OH上。 四、末端脱氧核苷酸转移酶 末端转移酶的功能主要有： 在载体或目的基因 3末端加上互补的同质多 聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接 。 用于DNA 3末端的同位素探针标记。 (A、G、C、T)n OH 5 3 5 3 OH 5 3 5 3 (A、G、C、T)n Mg2+ dNTP nppi Mg2+ dNTP nppi 5 3 OH 5 3 OH 5 3 5 3 (A、G、C、T)n Co2+ dNTP nppi Co2+ dNTP nppi （1）底物是单链DNA或有3突出末端的双链DNA，需要Mg2+ 。 （2）底物是平端或3凹端的双链DNA，需要Co2+。 (A、G、C、T)n 五、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）的作用 是催化去除DNA、RNA或dNTP上的 5-磷酸基团 。 主要用途有： 除去DNA片段上的5磷酸以防自身连接。 5- pCpGpC -OH 3 碱性磷酸酶 5- CpGpC -OH 3 5-p 3-HO 5-HO 3-HO 单击此处编辑母版标题样 式 单击此处编辑母版副标题样式 *45 第二节 载体 指能携带外源DNA片段导入宿主细胞 进行扩增或表达的工具。载体的本质为 DNA。 制备的目的基因或外源性DNA片段必 须与合适的载体连接形成重组体，才能进 入受体细胞并进行复制和表达。 载体包括克隆载体和表达载体。 载体（vector）: 能自我复制并具较高的拷贝数。 分子 量一般 10Kb。 带有遗传筛选标记。 有适当的限制酶切位点，便于外源基因 的插入和筛选。 载体上具有多个限制酶的单一切 点（即在载体的其它部位无这些酶的相 同切点）称为多克隆位点（multiple cloning sites，MCS） 。 载体应具备的特征： 多克隆位点 复制 起始 点 抗药基因 抗药基因 质粒(plasmid)载体 噬菌体(phage)载体 真核病毒(virus）载体 按来源分： PBR322；pUC系列；pGEM系列； M13mp系列；噬菌体载体；柯斯质粒（粘粒 ）； SV40载体；逆转录病毒载体；腺病毒载体； 克隆载体(cloning vector)： 用于克隆和扩增某一DNA序列，为研究提供 材料或建立基因库。 表达载体(expression vector)： 附加表达构件参与转录和翻译所必需的调 控序列，用于表达相关的蛋白质产品。 穿梭载体(shutter vector)： 既能在原核细胞中复制，又能在真核细胞中复 制表达的载体。 按功能分： 一、克隆载体 （一）质粒载体 质粒（plasmid）是指细菌染色体以外 的小分子环状双链DNA，能自我复制和表达其 携带的遗传信息。 分为“紧密型”和“松弛型” 质粒与宿主细胞的关系 （1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“ 借居”宿主细胞中 （2）质粒离开宿主就无法生存，必须依赖宿主细胞的质粒离开宿主就无法生存，必须依赖宿主细胞的 （）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或 酶），酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相 关的，如抗生素抗性基因： Ampr 酶，水解-内酰胺环,解除氨苄毒性,使细菌抗氨苄 。 Tetr 膜蛋白,可阻止四环素进入细胞,使细菌抗四环素。 用于保存和扩增 2Kb目的DNA。 构建cDNA文库。 目的DNA的测序。 作为核酸杂交时的探针来源。 质粒克隆载体的主要用途： Super-coiled form Relaxed circle Linearized form 质粒的理化性质 具有核酸分子的一般理化特性： 可嵌入某些染料 （溴化乙锭） 具有较强的抗切割和抗变性的能力 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳转GFP质粒DNA转染细胞 复制 起始点 抗药基因 抗药基因 图4-5 pBR322质粒的物理图谱 1. pBR322质粒载体 图4-6 pUC质粒物理图谱 2. pUC18、pUC19质粒载体 pUC18和pUC19质粒长约2.69Kb，除多克隆 位点互为相反方向排列外，其它序列均相同。 pUC质粒含Ampr，可供菌落筛选。 半乳糖苷酶的蓝白斑筛选实验： lacZ基因 -半乳糖苷酶氨基端 + 缺陷型-半乳糖苷酶 IPTG -半乳糖苷酶-互补 蓝色菌落 X-gal （二）噬菌体载体 噬菌体（bacteriophage，phage）： 指感染细菌的病毒。 （三）动物细胞基因克隆的载体 已构建并经常使用的动物病毒克隆载体有 ：猿猴空泡病毒40（simian vacuolating virus 40，SV40）载体、腺病毒（adenovirus）载体 和逆转录病毒（retrovirus）载体等，它们都有 各自的特点和应用范围。 原核细胞的表达载体主要是大肠杆 菌表达载体。大肠杆菌表达载体是在克 隆载体的基础上导入表达系统调控元件 ：启动子核糖体结合位点克隆位点 转录终止信号。 （一）原核细胞表达载体 二、表达载体 5TTGACATATAAT/3 -35区 -10区 转录起始点 Pribnow box DNA 如乳糖启动子（Lac）、色氨酸启动 子（Trp）、Tac启动子（Trp-Lac）以及 PL和PR启动子等。 原核细胞启动子示意图原核细胞启动子示意图 1. 启动子（promoter）： mRNA 核蛋白体小亚基 上的16S rRNA 2. SD序列 SD-SD-序列示意图序列示意图 一个基因的3末端有一特定的 DNA序列，它具有被RNA聚合酶识 别并停止转录的功能，此序列称为终 止子。该序列含有一段富含A/T和富 含G/C的回文对称结构，终止子转录 后形成的RNA具有茎环状局部二级 结构。 3. 终止子： -NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGC TTTTTTNNN- DNA -NNTT CGCGGCNNNNGGCCGCGAAAAAANNN- G/C富含区2G/C富含区1A/T富含区 5 35 3 RNA -NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH 5 3 RNA结构 5 G C N N N N C C G C G C G G C G C A U A U NNNN UUUU-OH 3 DNADNA转录的强转录的强 终止子模式图终止子模式图 转录 图4-8 pKK223-3质粒载体的物理图谱 （二）哺乳动物细胞表达载体 真核表达载体的真核表达元件有：启动子/增强 子克隆位点终止位点和加poly A信号。 1原核DNA序列 包括能在大肠杆菌中自身复制 的复制子和抗药基因的筛选标记。 2启动子 转录起始位点上游2530bp有富含AT 的TATA框，TATA框的上游约100200bp处为上 游启动子元件。 3增强子（enhancer） 是一类显著提高基因转 录效率的顺式作用元件。 4终止子和加polyA信号。 第三节 分子克隆的基本步骤 一、 目的基因的获取 二、 载体的选择 三、目的基因和载体酶切与连接 四、重组DNA导入受体细胞 五、重组体的筛选和鉴定 连接 含重组子的阳性克隆 载体+目的基因 转化、筛选和鉴定阳性克隆 DNA重组体 + 受体细胞 分 切 连 转 筛 基因工程步骤 分-分离目的基因DNA和载体DNA 从组织或器官中提 取并分离出某基因 DNA或cDNA 目的基因 DNA 质粒 染色体 基因克隆用细菌 提取载体 质粒DNA 质粒 DNA 质粒是细菌染 色体外双链环 状DNA，是基 因工程最常用 的载体之一。 目的基因可以来 源于动植物的组 织、培养的细胞 或者PCR产物 切-对目的基因DNA和载体DNA进行酶切修饰 目的DNA 限制性核 酸内切酶 质粒 DNA 基因克隆的载体 粘性末端 平末端 DNA经过酶切后产 生两种形式的末端 酶切后的质 粒示意图 酶切后的 质粒DNA 简单表示为 重组质粒 同种限制酶切除目的基因和载体，产生相互对 应的粘性末端，退火后以连接酶共价互补连接 。 连-目的基因连接到载体上，DNA连接酶连接切口。 转-即转化。以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入受体细胞的 过程称为转化(transformation）。 重组质粒 细 菌(CaCl2处理） 细 菌(CaCl2处理 ） 质粒导入未成功 质粒导入成功 质粒导入不成功 细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞称 谓感受态细胞(competent cell)。 筛-即筛选。筛选含有质粒的细菌和含有正确重组 DNA的细菌克隆 含重组质 粒的细菌 不含质粒的 细菌 含有抗生素的培养基 由于质粒本身能够 编码产生分解抗生 素的酶，因此，凡 是转化成功的细菌 就能够在含有抗生 素的培养基中生长 。 含质粒的细菌 （自身环化） 含有质粒者 才能生存 单击此处编辑母版标题样 式 单击此处编辑母版副标题样式 *73 一、 目的基因的获取 （一）从基因文库中获取 （二）逆转录法 （三）人工合成DNA片段 （四）直接从染色体DNA中分离 目的基因 （一）从基因文库中获取 目的基因： 指被研究的某一基因或DNA序列，即需 要克隆或表达的基因。 基因组文库（genomic library，G-文库）是指 含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群 。 cDNA文库（cDNA library）：以细胞全部 mRNA经逆转录，制备出全套cDNA建库。 构建G文库筛选目的基因 一、分离基因组DNA 二、载体的选择（一般为噬菌体） 三、将基因组DNA片段连接入载体 四、将重组载体转入宿主细胞 n组织细胞 n 破碎细胞，除去DNA与蛋白质 n提取总RNA n Oligo(dT)纤维素亲和层析 n制备mRNA n 反转录 n合成cDNA第一链 n合成cDNA第二链 n合成cDNA双链 n 插入载体 n重组DNA n 导入大肠杆菌扩增 n构建cDNA 文库 构建cDNA文库筛选目的基因 （二）逆转录PCR法。 选用富含目的基因mRNA的细胞作为 实验材料，有利于分离到目的基因。如胰 岛素基因的mRNA主要存在于胰腺组织， 血红蛋白基因的mRNA占网质红细胞总 mRNA的50%90%。 PCR 特点：短时间获得 大量DNA片段。 （三）人工合成DNA片段 根据已知某种基因的核苷酸序列，再用 DNA合成仪人工合成目的基因,可分段合成 。此法适用于合成分子量较小的目的基因 （100bp以内），如：人生长激素释放因子 、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素 原的基因等。 （四）直接从染色体DNA中分离目的 基因 根据染色体DNA的限制性内切酶图谱， 用适当的限制性内切酶切割染色体DNA、分 离目的基因。本方法较适用于制备原核生物 目的基因， 二、 载体的选择 噬菌体和粘性质粒载体常用来构建基因组文 库 pUC系列等质粒常用来构建cDNA文库和克隆 较小DNA片段 M13噬菌体则用于克隆一些待测的DNA序列。 三、目的基因和载体酶切与连接 (一)粘性末端连接 本法适用于在 质粒和目的基 因上有相同单 或双酶切位点 图4-10A 粘性末端DNA重组体的构建 图4-10B 粘性末端DNA重组体的构建 3 HO-G CTTAA-p 5 5p-AATTC G-OH 3 3HO-G CTTAA-p 5 5p-AATTC G-OH 3 质粒 目的基因 目的基因 和载体连接 EcoR EcoR 碱性磷酸酶 3HO-G CTTAA-OH 5 5HO -AATTC G-OH 3 退火 DNA连接酶 3HO-G CTTAA G CTTAA-p 5 5p AATTC G AATTC G-OH 3 (二) 平末端连接 质粒 产生平末端的 内切酶 DNA连接酶 目的基因目的基因 重组质粒 产生粘性末 端的内切酶 产生粘性末 端的内切酶 核酸酶S1 核酸酶S1 1质粒和目的基因上没有相同的酶切位点 平末端连接模式图平末端连接模式图 本法适用于在 质粒和目的基 因上没有相同 的酶切位点 图 人工接头构建 DNA重组体 2人工接头 3. 通过同聚尾连接 本法适用于在 质粒和目的基 因上没有相同 的酶切位点 图 同聚尾连接法构 建 DNA重组体 质粒 目的基因 3 3 3ACGTC G 5 5G CTGCA 3 3 GnGGGACGTC G 5 5G CTGCAGGGGn 3 3 CnCCC 5 5 CCCCn 3 末端转移酶 dGTP 末端转移酶 dCTP 混合，退火 1）转化细菌 2）体内修复 图4-12-B 同聚尾连 接法构建 DNA重组体 G CCCC GGGGACGTC CTGCAGGGG CCCC G Pst 核酸外切酶 目的基因和 载体连接 GACGT C CTGCA G G ACGTC C TGCAG CCC GGG GGG CCC Pst Pst 通过PCR技术 n引物设计时导入限制性酶切位点 四、重组DNA导入受体细胞 以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入受 体细胞的过程称为转化(transformation）。 对受体细胞的要求： 容易接纳重组分子（处于感受态） 对载体的复制扩增无严格限制 不存在特异的内切酶体系降解外源DNA（R-） 不对外源DNA进行修饰（Rec-） 符合“重组DNA操作规则”安全标准(sars) 常用的受体细胞是大肠杆菌。重组DNA导入大肠杆 菌方法： 1. CaCl2处理，增加大肠杆菌细胞膜通透性。 2.电穿孔法，效率最高。 3.体外包装DNA重组体，再转染宿主细胞（噬菌体）。 感受态细胞(competent cell): 细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外 源DNA能力的细胞 重组DNA导入哺乳动物细胞的方法 1.DNA-磷酸钙共沉淀 2.病毒感染法 RNA病毒与DNA病毒，polybrene（凝聚胺） 电荷中和作用 3.显微注射法 转基因动物研究 阳性克隆： 指目的DNA重组体转入宿主细胞的克隆。 阳性克隆的筛选: 直接筛选法 遗传学表型改变(抗性基因、蓝白斑等） 间接筛选法 核酸水平（限制酶切、PCR扩增），杂交法 蛋白质